秦　佑，杨瑞仪，陈梅果，沈小玲，胡英杰

(广州中医药大学热带医学研究所中药新药发现实验室，广东 广州　510405)



树豆酮酸A抑制3T3-L1细胞脂肪合成与分解的作用研究

秦佑，杨瑞仪，陈梅果，沈小玲，胡英杰

(广州中医药大学热带医学研究所中药新药发现实验室，广东 广州510405)

中国图书分类号：R284.1；R329.24；R344.7；R394.2 ；R589.2

摘要：目的探讨树豆酮酸A(cajanonic acid A，CAA)对小鼠3T3-L1脂肪细胞脂质代谢的影响及其机制。方法诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞加入不同浓度的CAA作用48 h后，进行总脂肪、甘油三酯、游离脂肪酸和甘油含量测定。实时荧光定量PCR法检测脂质代谢相关基因的表达。结果CAA明显降低3T3-L1脂肪细胞总脂肪和甘油三酯含量，抑制游离脂肪酸和甘油的释放，下调乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase，HSL)和脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)基因的表达，但增加乙酰辅酶A氧化酶(acyl CoA oxidase，ACOX)和肉碱棕榈酰转移酶-1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1)基因的mRNA水平。结论CAA通过抑制脂肪吸收与合成相关基因(ACC、FAS、LPL)的表达，减少脂肪细胞甘油三酯的合成，抑制细胞过度肥大。同时，下调脂肪分解限速酶基因(HSL、ATGL)mRNA水平，促进脂肪酸氧化关键基因(ACOX和CPT-1)的表达，减少游离脂肪酸的释放，改善脂肪细胞的脂质代谢平衡。

关键词：树豆酮酸A；脂肪细胞；脂肪合成；脂肪分解；脂肪酸氧化；游离脂肪酸

白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)是机体重要的贮存脂肪、调节能量代谢平衡的组织。在WAT中，脂质的合成与分解效率直接呈正相关[1]。机体内脂肪需进行不断地更新：一方面，外源性的脂肪通过血浆转运，以游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)的形式进入脂肪细胞，再合成脂肪储存；另一方面，储存的脂肪不断分解，以FFA的形式进入各组织，然后被氧化利用供能，使脂肪代谢保持动态平衡。进食过多的热量可促进甘油三酯(triglyceride，TG)的合成导致肥胖，而超重或肥胖者体内的脂肪堆积使脂肪分解更加活跃，释放更多的FFA，血中FFA增加引发血脂紊乱，抑制葡萄糖利用，降低胰岛素敏感性，继而诱发胰岛素抵抗、2型糖尿病等代谢综合征。

树豆(CajanuscajanL. Millspaugh)是蝶形花科木豆属多年生灌木。研究表明，其菧类提取物能有效降血糖，并降低血清和肝脏的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平，改善高脂血症[2-3]。树豆酮酸A是从树豆提取物中分离出来的一种菧类化合物，该化合物对高糖高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的2型糖尿病SD大鼠及自发性肥胖伴高血糖高血脂模型(Zucker fa/fa大鼠、ob/ob小鼠、db/db小鼠)均能起到减轻体重，降低血糖、血脂，增强胰岛素敏感性的作用[4]。但其作用机制尚未明确。有鉴于此，我们在本研究中以小鼠3T3-L1前脂肪细胞诱导分化WAT细胞为模型，研究树豆酮酸A对脂肪细胞脂质代谢的影响。

1材料

1.1细胞株3T3-L1前脂肪细胞株由香港城市大学生物及化学实验室惠赠。

1.2试剂与仪器高糖Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)细胞培养液、胎牛血清：美国Gibco公司；CCK8：美国Sigma-aldrich公司，批号FJ692；液体样品甘油含量Glycerophosphate oxidase- Peroxidase (GPO-POD) 酶法测定试剂盒：普利莱基因有限公司，批号E1002； TG测定试剂盒、FFA测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为：20150611、20150311；Revertra First Strand cDNA Synthesis Kit、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix：日本TOYOBO公司，批号分别为：451100、453300；ABI 7500实时荧光定量PCR仪：美国应用生物系统公司；Thermo Scientific MK3型酶标仪：Thermo Fisher 公司；CK40倒置光学显微镜：美国Olympus公司。引物的设计和合成：上海生工生物技术有限公司。

2方法

2.1细胞培养及分化诱导小鼠3T3-L1前脂肪细胞株，用培养基(含10%胎牛血清的高糖DMEM)，在37℃、5% CO2的培养箱中培养。细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔培养板中，待细胞汇合后接触抑制48 h，换用含0.5 mmol·L-13-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)、0.25 μmol·L-1dexamethasone(DEX)和10 mg·L-1胰岛素的培养基培养48 h。然后换用含10 mg·L-1胰岛素的培养基培养48 h，再换用培养基继续培养，每2天换液1次，诱导分化至d 8细胞 90%以上呈脂肪细胞表型。

2.2CAA分离与鉴定树豆叶粗粉经乙醇提取，依次经石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部位经柱层析分离得到CAA，核磁共振谱和质谱鉴定。

2.3CCK8测定细胞生存率3T3-L1前脂肪细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔培养板中，当细胞融合率达到60%~70%后，换成含0(空白对照组)、25、50、100 μmol·L-1CAA的培养基孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK8继续孵育1.5 h，震荡混匀，酶标仪检测450 nm波长吸收值A。存活率/%=(药物组A值-调零A值)/(空白组A值-调零A值)×100%，计算细胞存活率。

2.4油红O测定细胞总脂量3T3-L1前脂肪细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔培养板，按“2.1”方法诱导分化为成熟的脂肪细胞后，添加0(空白对照组)、25、50、100 μmol·L-1CAA，并设未分化组进行对照。48 h后，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞3次，10%福尔马林固定20 min，PBS 清洗3次晾干，每孔加入100 μL油红O 染色液静置20 min，倒掉染色液，以PBS 洗2次，除去多余染料，倒置显微镜下拍照。然后每孔加入150 μL异丙醇，震荡1 min，酶标仪检测492 nm 波长吸收值A。

2.5TG、甘油、FFA测定细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔培养板，同“2.4”加入CAA处理48 h后，取各孔培养液，分别用试剂盒检测FFA、TG和甘油含量。

2.6实时荧光定量PCR检测基因表达收集细胞并裂解，按说明书提取RNA。取2 μg RNA，按Revertra First Strand cDNA Synthesis kit说明书进行逆转录，合成cDNA，然后以其为模板加入引物、ROX Referencedye和Thunderbird SYBR qPCR Mix，以β-actin基因为内参，按照说明书进行实时荧光定量PCR分析。实验所用引物序列如Tab 1所示。

Tab 1　Primers designed for quantitative amplification

3结果

3.1CAA对3T3-L1细胞增殖的影响实验中以不同浓度CAA(25、50、100 μmol·L-1)作用3T3-L1前脂肪细胞48 h后，细胞存活率分别为99.97%、101.36%和93.25%，与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见Tab 2。表明CAA终浓度在25~100 μmol·L-1范围内对3T3-L1前脂肪细胞增殖无影响。

Tab 2CAA showed no effect on viability

GroupCAA/μmol·L-1Survivalrate/%Control0100CAA2599.97±2.9650101.36±1.6810093.25±11.06

3.2CAA抑制脂肪细胞脂质与TG合成根据CCK8结果，使用25、50、100 μmol·L-1CAA作用已诱导分化成熟的脂肪细胞，油红O脂类染色法检测细胞脂质合成。镜检显示，未分化的3T3-L1前脂肪细胞呈梭状，而分化成熟的脂肪细胞呈圆形。随着CAA添加浓度的增高，脂肪细胞变小，油红O沉淀也依次减少。以异丙醇溶解细胞内沉淀的油红O，采用酶标仪进行定量检测。与前脂肪细胞比较，分化成熟的脂肪细胞A值明显升高(P<0.01)，表明脂肪含量明显增加；添加CAA处理48 h后，脂肪含量则明显下降(P<0.01)，见Tab 3。与CAA减少脂肪细胞总脂质含量的结果一致，CAA同样抑制脂肪细胞TG的生成，与不加CAA对照组比较差异有显著性(P<0.05, Tab 4)。结果表明，CAA具有明显抑制脂肪细胞脂肪合成的作用，且随剂量增加而作用增强。

Tab 3 Inhibitory effects of CAA

*##P<0.01vspreadipocytes；**P<0.01vsthe group of adipocytes without CAA treatment.

3.3CAA抑制脂肪细胞甘油和FFA的释放如Tab 4所示，与对照组比较，CAA低剂量组(25 μmol·L-1)可减少脂肪细胞甘油和FAA的释放，但无统计学意义。CAA 中剂量和高剂量组(50、100 μmol·L-1)作用浓度能明显抑制甘油FAA的释放，且与对照组比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。结果表明，CAA对脂肪细胞的脂肪分解有抑制作用。

3.4CAA对脂肪代谢相关基因表达水平的影响实验定量检测了ACC和FAS(脂肪酸从头合成关键酶)、LPL(与脂肪酸吸收相关)、ATGL和HSL(TG分解的限速酶)、ACOX和CPT-1(脂肪酸氧化限速酶)编码基因的mRNA水平，发现与未分化的前脂肪细胞比较，脂肪细胞ACC、FAS、LPL、ATGL、HSL、ACOX、CPT-1表达水平均大幅提升(P<0.01，Fig 1)，表明由于脂肪细胞内脂代谢活跃，其相关基因表达也相应提高。CAA作用后，ACC、FAS、LPL、ATGL、HSL mRNA水平明显下降(P<0.05或P<0.01，Fig 1)，与CAA对脂肪细胞脂肪合成与分解的抑制作用一致。但CPT-1、ACOX mRNA表达水平明显提高(P<0.05或P<0.01，Fig 1)，提示CAA可能对脂肪酸氧化有促进作用。

4讨论

本研究观察了树豆酮酸A对脂肪细胞脂质合成与分解的作用，结果显示，树豆酮酸A明显抑制TG的合成，并明显抑制甘油和FFA的释放。TG在体内合成所需的脂酰CoA，主要有两种来源：一是以乙酰CoA为原料的从头合成途径，ACC和FAS是参与合成的两个关键酶；二是脂肪酸碳链延长的合成途径，通过吸收血液中的FFA或利用细胞中TG分解的FFA，由脂酰CoA合成酶催化合成脂酰CoA，实现FFA再酯化。血液中的乳糜微粒和极低密度脂蛋白所携带的TG在LPL催化下降解为甘油和FFA，后者通过细胞表面的CD36途径进入细胞。因此，LPL在细胞获取FFA过程中起关键作用[5]。而HSL和ATGL则是脂肪细胞内TG水解的限速酶[6]。本研究的结果显示，树豆酮酸A通过下调ACC、FAS、LPL、HSL和ATGL的表达，从而抑制脂肪细胞内两条TG合成途径，减少TG等脂质合成，并抑制TG降解，减少甘油和FFA的释放。

Tab 4　Inhibitory effects of CAA on TG, FFA and glycerin in ±s，n=12)

—：Undetected.##P<0.01vspreadipocytes；*P<0.05，**P<0.01vsthe group of adipocytes without CAA treatment

Fig 1　Effects of CAA on mRNA levels of genes related to lipid ±s，n=4)

在脂肪细胞分化早、中期阶段，LPL、ACC和FAS的表达量依次明显增高，细胞内的脂质合成加速，使脂肪细胞体积增大。到脂肪细胞分化成熟时，HSL和ATGL的表达也会明显提高，提示细胞内脂肪分解也开始变得活跃[7]。因此，脂肪细胞的脂质合成与分解维持着一种动态平衡，当脂肪积累超出负荷时，脂质分解会增加，引起FFA升高、高甘油三脂血症，使人体糖脂代谢紊乱。在减少脂肪细胞脂质合成的同时，抑制脂解更有利于维持更健康的能量代谢平衡。有资料显示，抑制ATGL与HSL的表达与活性可有效抑制脂解反应，改善代谢综合征[8-9]。通过节食或锻炼使体重下降，其HSL表达也随之下降，相应地FFA也会减少[10]。特异性敲除小鼠脂肪细胞的ATGL基因，在抑制脂解、降低血脂的同时，与脂肪吸收、合成相关基因表达也受到抑制，肝胰岛素信号通路增强，葡萄糖耐受性得到改善[11]。LPL与脂蛋白中TG的降解及FFA吸收密切相关，其生理效应具有组织特异性差异。脂肪组织特异性LPL减少或缺失可减少先天肥胖ob/ob小鼠的脂肪储存[12]。另有研究表明，下调WAT中LPL和FAS的表达，可有效抑制脂肪细胞的过度肥大[13]。

本研究的结果还显示，树豆酮酸A上调ACOX和CPT-1的mRNA水平。ACOX和CPT-1是FFA β氧化过程的限速酶，其表达量提高提示树豆酮酸A对脂肪细胞的脂肪酸氧化可能有促进作用。在脂酰CoA从头合成途径中，ACC催化乙酰CoA产生丙二酰CoA(malonyl-CoA)。以往的研究表明，丙二酰CoA可通过抑制CPT-1而抑制脂肪酸氧化。ACC表达下降可活化CPT-1，从而在抑制脂肪合成的同时，促进脂肪酸氧化和葡萄糖吸收[14-15]。脂肪酸再酯化贮能、脂肪酸氧化供能是脂肪酸代谢的两个方面，当脂肪酸再酯化能力下降，FFA富余的情况下，高效的脂肪酸氧化有助于维持细胞内能量平衡[16]。如有研究显示，长时间中低强度运动会抑制内脏与皮下脂肪细胞脂质合成与分解，同时促进脂肪酸氧化参与供能，将体内储能的WAT，转化为提供能量的褐色脂肪[1]。

综上所述，树豆酮酸A通过下调ACC、FAS、LPL、HSL、ATGL，上调ACOX、CPT-I的表达，抑制脂肪细胞TG的合成与分解、促进脂肪酸过氧化，减少FFA的释放，起到减肥降脂的作用。令人惊喜的是，树豆酮酸A还具有改善地塞米松诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗、增加糖消耗的作用；在体内也显示良好的降血糖、血脂，减肥作用[4]。其治疗肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病的开发前景值得期待。

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Inhibitory effect of cajanonic acid A on lipogenesis and lipolysis in 3T3-L1 adipocytes

QIN You，YANG Rui-yi，CHEN Mei-guo，SHEN Xiao-ling，HU Ying-jie

(LaboratoryofChineseHerbalDrugDiscovery,TropicalMedicineInstitute,Guangzhou510405,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of cajanonic acid A (CAA) on lipid metabolism in murine 3T3-L1 adipocytes. Methods3T3-L1 cells induced to differentiated into mature adipocytes were treated with CAA in different dosages for 48 h, then total lipids as well as triglyceride, free fatty acid and glycerol were measured. The expression levels of genes related to lipid metabolism were quantitatively analyzed by real-time fluorescent quantitative polymearase chain reaction (RTFQ-PCR). ResultsTotal lipids and triglyceride in 3T3-L1 adipocytes were markedly reduced by CAA. The release of free fatty acid and glycerol was lower than that of control. This coincided with decreased mRNA levels of the key enzymes involved in de novo lipogenesis (acetyl CoA carboxylase and fatty acid synthase), fatty acid uptake (lipoprotein lipase), and lipolysis (hormone sensitive lipase and adipose triglyceride lipase). While the expression of fatty acid oxidative genes including acyl CoA oxidase and carnitine palmitoyl transferase1 was increased after CAA treatment. ConclusionCAA may inhibit lipogenesis and lipolysis，reduce circulating free fatty acid and improve the lipid metabolism in adipocytes by regulating gene expressions.

Key words:cajanonic acid A；adipocytes；lipogenesis；lipolysis；fatty acid oxidation；free fatty acid

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)02-0189-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.009

作者简介：秦佑(1990-)，女，硕士生，研究方向：创新中药研究，E-mail：youqincqmu@163.com；杨瑞仪(1972-)，女，博士，研究员，硕士生导师，研究方向：创新中药研究，通讯作者，Tel：020-36585100，E-mail：rysyry@gzucm.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 81202968)；华南中医药协同创新中心团队资助项目(No E1-KFD015141K05)

收稿日期：2015-10-29,修回日期：2015-11-19

网络出版时间：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.018.html网络出版地址：2016-1-25 15:57