谭剀心邹俣希

重庆地区特异性分枝杆菌噬菌体的分离与裂解肽效能研究

谭剀心邹俣希

分离新的分枝杆菌噬菌体，研究其生物学特性，以及裂解酶，将有助于控制分枝杆菌在环境中的传播，丰富对噬菌体多样性的认识。噬菌体的裂解性肽段可以与其他化合物分子耦合，成为双功能分子，如与抗疟疾的青蒿素结合，可同时杀灭分枝杆菌和疟原虫。

实验方法

噬菌体分离纯化。分别取5份土样10g，加入15ml MP buffer、30μl Amp（50mg/ml）和1ml 新鲜培养的耻垢分枝杆菌悬浊液，混匀。于37℃，160r/min培养过夜。

分别取三份污水样品300μl，加入新鲜培养的耻垢分枝杆菌宿主菌悬液1mL，LB液体培养基35ml， MP buffer15ml，Amp（50mg/ml）30μl加 CaCl2至终浓度1mmol/L，置37℃，160r/min培养过夜。

取培养过夜样品12000r/min离心6min，取上清用0.22μm过滤器过滤除菌。将滤液进行倍比稀释。取1ml耻垢分枝杆菌悬浊液，与3ml滤液混合静置15min。取2ml宿主菌-噬菌体悬液，再加入4ml水琼脂（ 0.7%的琼脂,1mM CaCl2），加入Middlebrook的7H10/ Amp平板上，37℃培养过夜。观察噬菌斑形成情况。噬菌斑形成时，挑取透明单个噬菌斑接种至宿主菌培养液中进行扩增，经3～5次反复纯化后得形状大小一致的噬菌斑。

噬菌体一步生长曲线。培养200ml耻垢分枝杆菌（含20%Tween80）至OD600达到0.6～0.8。用新鲜7H9

培养基（无Tween80）洗菌体3遍，去除Tween80。在菌液中加入噬菌体，使其MOI达到10。混匀后，37℃温育30min。13000 r/min离心30s，取上清，用MP buffer重悬，置于37℃摇床，110r/min震荡培养。从40min起每隔45min取样50ul，13000 r/min离心30s。取上清，倍比稀释后用双层平板法测定噬菌体滴度。重复实验3次，绘制一步生长曲线。

噬菌体裂解效能实验。采用平板法测定污水中总菌数。分别取一份污水样品10ml，13000r/min离心5min，加入噬菌体悬液1ml，混合5min后倍比稀释8倍，取不同稀释度的混合液1ml，涂布于7H9固体平板陪养过夜，计算总菌数。……