韩佩晏，吕红彬

作者单位：(646000)中国四川省泸州市，西南医科大学附属医院眼科



·文献综述·

糖尿病视网膜病变与凋亡相关因子的研究进展

韩佩晏，吕红彬

作者单位：(646000)中国四川省泸州市，西南医科大学附属医院眼科

Citation:Han PY, Lü HB. Research progress of diabetic retinopathy and apoptosis-relating genes.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(5):859-863

摘要

细胞凋亡是一个复杂的多基因调控过程，其参与了糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的发病机制，B细胞淋巴瘤/白血病2(B-cell leukemia/lymphoma-2，Bcl-2)、Fas等都是重要的凋亡调节基因。本文就DR与凋亡的关系及其某些相关基因的表达予以综述。

关键词：糖尿病视网膜病变；凋亡；B细胞白血病/淋巴瘤2；细胞因子

引用：韩佩晏，吕红彬.糖尿病视网膜病变与凋亡相关因子的研究进展.国际眼科杂志2016;16(5):859-863

0引言

糖尿病是在全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)在2011年的报道，全球约有3.66亿人患有糖尿病，而这一数据在2030年将会达到5.52亿[1]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的并发症之一，已成为全球工作年龄人群致盲的首要原因。其临床特征主要有毛细血管通透性增加、视网膜水肿以及内皮细胞增生[2]。糖尿病导致DR发生的机制非常复杂，目前尚未完全明确。其发病机制的研究主要集中在多元醇通路、非酶糖基化学说、氧化应激和蛋白激酶C的活化等，无论哪一种机制视网膜细胞的凋亡是其共同的通路[2]。大多数的研究更关注血管的改变，而在视网膜发生血管病变之前会出现一些退行性的改变，包括神经节细胞凋亡、小胶质细胞激活、谷氨酸代谢改变等[3]。由STZ诱导的糖尿病大鼠在糖尿病发生后很快就会出现视网膜神经和血管细胞的凋亡[4]。目前视网膜细胞凋亡已被视作导致视网膜神经退行性改变、血管功能异常、DR、青光眼等不可逆致盲眼病的中心事件[4]。本文就凋亡相关基因与DR的研究进展予以综述。

1细胞凋亡的特征及相关基因

1.1细胞凋亡的概况细胞凋亡(apoptosis)是指生物体为维持内环境稳定，细胞在一定的生理或病理条件下，由基因控制的高度有序的并由一系列酶活动参与的细胞自主的死亡，是生物体为了更好地适应生存环境，遵循自身的程序而主动结束其生命的过程，又称为细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控[5]。凋亡的细胞有细胞质出泡和细胞核出泡的现象。伴随着出泡现象的发生，细胞核发生了改变，染色质固缩，附着于核膜上，产生大小不同的被膜包围的凋亡小体。凋亡小体被周边有吞噬功能的细胞吞噬清除，从而避免了炎症反应的发生。细胞凋亡是受凋亡相关基因调控的，它可自动地清除多余的特异性或分化能力和机体不相适应的、以及已经完成功能而又不再应用的细胞；清除有潜在危险的细胞，如自身反应性淋巴细胞，DNA损伤又得不到修复的癌化危险细胞等。细胞凋亡可由以下因素来诱导：(1)理化因素：如射线、高温、抗癌药物等；(2)激素和生长因子失衡；(3)免疫因素；(4)生物因素：细菌、病毒等病原微生物。大多数情况下，来自于细胞外的细胞凋亡诱导因素作用于细胞后可转化为细胞凋亡信号，并通过胞内不同的信号转导途径，最终激活细胞死亡程序，导致细胞凋亡。因此，凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。当调控凋亡的基因接收到信号转导途径传来的死亡信号后，就按照既定的程序启动，并合成执行凋亡所需的各种酶类及相关物质。

1.2细胞凋亡的基因控制细胞凋亡是多基因调控的过程。根据对细胞凋亡作用的不同，将细胞凋亡调控基因分为两大类：一类为促进细胞凋亡的基因，如线虫的ced-3、ced-4，哺乳动物的ICE(IL-1β converting enzyme，ICE)、野生型p53、Fas/Apo-1等；另一类为抑制细胞凋亡的基因，称为细胞死亡抑制基因(cell death suppressor gene)，如线虫的ced-9、哺乳动物的Bcl-2[6]。

Bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/leukemia，Bcl-2)的缩写形式，它是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，是研究最早且与凋亡有关的、位于t(14，18)染色体异位断点的原癌基因，是人类滤泡型淋巴瘤的细胞遗传标志物，具有阻断程序化细胞死亡的作用。Bcl-2蛋白主要分布在线粒体内膜、细胞膜内表面、内质网、核膜等处。广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞。Bcl-2的高表达能抑制多种凋亡诱导因素(如射线和化学药物等)所引发的细胞凋亡，如依赖神经生长因子的神经细胞，当撤除神经生长因子后，细胞会迅速发生凋亡，如果将表达Bcl-2的基因质粒注入细胞中，则可防止神经细胞凋亡。目前认为该家族可细分成两大类：抗凋亡成员，如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、髓细胞白血病因子-1(MCL-1)、Bcl-2相关蛋白A1、Bcl-B等，它们能使细胞免受凋亡；促凋亡成员，如Bax、Bik、Bak、BH3-only死亡蛋白。

p53作为一种抑癌基因，在促进肿瘤细胞发生凋亡中有重要的作用。野生型的p53基因编码的p53蛋白是一种DNA结合蛋白，该蛋白在细胞周期的G期发挥调控点的作用，负责检查染色体DNA是否损伤，一旦发现有缺陷DNA，它启动DNA修复机制。如果修复失败，则活化诱导细胞凋亡基因(如bax)的转录，促使损伤的细胞凋亡，避免细胞的癌变。若p53突变，则此功能丧失，且促进细胞增殖。

Myc是常见的一种原癌基因，其基因家族主要含有三个成员：c-myc基因、N-myc基因、L-myc基因，c-myc既具有转录的功能又能抑制转录；既能诱导细胞周期的进程又有产生程序细胞死亡的作用。这主要是因为c-myc基因可以产生两种翻译产物，c-myc1和c-myc2，其作用是不同的，甚至可以说是相反的。可以认为c-Myc2与细胞的生长、分化和增殖与肿瘤的发生有关；c-Myc1有抑制c-Myc2的作用，但在不同时期、不同位点表现出不同的功能，同时还受本身质和量的影响，也受细胞所处微环境的影响。总之，c-myc基因及其表达蛋白产物c-Myc12在细胞的生长、分化过程中起重要作用，弄清它们的结构及作用机制，对于疾病的诊治具有重要的意义。

Fas是肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子，Fas配体(fas ligand，FasL)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)家族的细胞表面分子。FasL与其受体Fas结合导致携带Fas的细胞凋亡，故称之为死亡受体。人的Fas包含325个氨基酸。氨基端有信息顺序(signal sequence)，分子中都有跨膜区，属I类膜蛋白，分子量为45kD。结构分析证实Fas属于TNF和NGF受体家族。研究表明多种哺乳细胞表达Fas，而FasL仅表达于活化的T细胞。抗Fas抗体、表达FasL的细胞和可溶性的FasL与Fas交联均产生细胞凋亡信息。经Fas诱导的细胞凋亡有以下几个特点：(1)细胞浆及细胞核出现固缩及片段形成；(2)凋亡并不要求有细胞核存在；(3)不依赖于细胞外钙离子及细胞内大分子合成；(4)Bcl-2过度表达或Bcl-2与结合蛋白BAG-1的共表达(coexpression)能抑制Fas致凋亡作用。

肿瘤坏死因子(TNF)是一种具有多种生物学效应的细胞因子，包括促进细胞生长、分化、凋亡及炎症诱发等。大多数正常细胞能抵抗TNF的细胞凋亡作用，被认为是由于在TNF与受体结合后细胞内缺乏某种令细胞裂解的信号；或由于TNF作用后细胞产生了保护性蛋白，使其免受TNF的细胞毒作用。研究发现，TNF能诱导某些正常细胞凋亡，并提示当机体处于某病理状态时，这些作用具有一定的病理生理学意义。TNF诱导人或动物血管内皮细胞、心肌细胞、肝细胞、造血干细胞、肾小球系膜细胞等细胞凋亡。TNF-α对DR的发生发展起着重要的作用，表现在TNF-α参与视网膜血管屏障的破坏、血管通透性增加、视网膜局部缺氧等病理改变[7]。

目前在哺乳动物细胞中已发现14种ICE/Ced-3蛋白酶家族成员，称为天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)，又称为“半胱天冬酶”。它们具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性。其家族成员的命名按发现的先后时间，在“caspase”后以阿拉伯数字表示，现已发现的caspase有caspas-1～14。根据caspase的功能，可将其分为两大家族，一是caspase-1大家族，该亚家族成员主要参与炎症反应；另一caspase-3亚家族包括caspase-3、6～10等，它们介导细胞凋亡。细胞凋亡激活的生化途径包括细胞内、细胞外和caspase依赖型、非caspase依赖型[8]。启动型凋亡蛋白包括caspase-8、-9，一旦激活，这些蛋白便裂解并激活下游的效应凋亡蛋白，包括caspase-3、-6、-7，以执行凋亡[9]。Oshitari等[10]通过实验证明表达上调的caspase-3、-9和Bax与DR节细胞层的神经退行性改变密切相关。

2 DR与细胞凋亡

2.1 DR的病理变化DR中首先出现的病理改变是覆盖视网膜毛细血管的周细胞减少。毛细血管内皮细胞凋亡是由以下一些原因引起：如糖代谢异常、蛋白激酶C的激活、AGE的形成、ROS的增多、Müller细胞促炎症因子的释放、视网膜小胶质细胞或黏附于毛细血管内皮细胞的白细胞、由血小板衍化生长因子激发的生存信号丢失、抑制血管生成信号或一些其他因子的上调[11]。再灌注损伤和视网膜缺血能引起促新生血管因子的上调，如VEGF、促红细胞生成素以及其他血管生成因子。这些因子能促进增生性DR的发生，并且引起血管渗漏。视力损害可继发于视网膜前血管形成后所致的玻璃体出血或黄斑前膜。细胞内稳态的改变以及血管生理的改变能引起一些血管并发症，能影响所有血管细胞的主要功能。血管通透性的增加以及周细胞的凋亡是DR的显著特征[12]。

Mizutani等[13]曾采用TUNEL法检测经胰蛋白酶消化过的人体及动物的视网膜血管的凋亡，结果显示相较于没有糖尿病的志愿者，在平均有9±4a糖尿病史的志愿者的离体视网膜标本中检测出少量但很显著的血管细胞凋亡。在采用STZ诱导31wk后的糖尿病大鼠的视网膜中同样能得出这样的结果[14]。还有一些其他研究同样证明了在糖尿病视网膜[15]和db/db小鼠[16]视网膜中的血管凋亡明显增多。Podest等[17]用TUNEL标记人体的视网膜周细胞，发现在糖尿病患者中的阳性率是增高的，并且Bax的局部免疫反应性是增加的。对离体人视网膜进行的实验显示，一些血管虽然没有周细胞但仍有完整的内皮细胞，并且有微动脉瘤的血管通常没有周细胞，这说明周细胞的缺失使内皮细胞的增长不受控制[18]。先采用胰蛋白酶使血管细胞从视网膜中分离再行病理检查，STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜及离体人视网膜的组织切片用TUNEL标记，结果显示糖尿病能增加神经细胞的凋亡，特别是在神经节细胞所在的内层视网膜[19]。当TUNEL标记应用于全视网膜时，凋亡细胞的数量就能够量化，且大概是经胰蛋白酶消化的视网膜的10倍，这意味着在糖尿病中非血管细胞同样在发生凋亡[20]。这些发现预示着神经细胞凋亡较血管细胞早，并且神经细胞凋亡的比例在糖尿病的病程中较为恒定。其他研究者采用同样的方法也得出同样的结果[21]。以上实验都证明了糖尿病能引起视网膜神经细胞和血管细胞的凋亡，并且神经细胞的凋亡发生更早、持续时间更长。

2.2 Bcl-2在DR中的表达Bcl-2家族被分为抗凋亡和促凋亡蛋白。抗凋亡Bcl-2蛋白能通过结合或抑制促凋亡蛋白以促生存及保持线粒体外膜的完整性；促凋亡蛋白能促进死亡和中和抗凋亡Bcl-2蛋白，并且能激活线粒体外膜的透化作用(MOMP)[22]。抗凋亡Bcl-2蛋白最初的功能是对抗促凋亡Bcl-2蛋白，从而抑制MOMP，并且阻断线粒体凋亡通路。在早期糖尿病大鼠视网膜血管和神经细胞中，凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达随病程的进展而增强，二者在糖尿病视网膜细胞凋亡中起重要作用。研究发现，将视网膜毛细血管周细胞置于高浓度的葡萄糖溶液中体外培养，观察到毛细血管周细胞的大量凋亡，并且细胞中Bcl-2/Bax的比率降低，由此认为Bax基因表达增强与Bcl-2基因表达减少可能加速了周细胞的凋亡，对周细胞的凋亡起到了调控作用。Bcl-2作为一个抗凋亡因子，能够抑制细胞色素C的释放以及促凋亡因子的活动。Li等[23]通过STZ诱导糖尿病小鼠模型，并采用免疫组织化学、Western blot等对Bcl-2、Bax进行检测，发现其在神经节细胞层(GCL)及内颗粒层(INL)的表达呈阳性，糖尿病组相较于正常组Bax的表达显著升高，Bcl-2的表达相对减少，Bcl-2/Bax值明显减低的。在糖尿病患者视网膜中同样能发现神经细胞的凋亡，这一点与动物实验相同。有数据表明在糖尿病视网膜中能发现血管及神经的凋亡[24]。

2.3 Fas/FasL在DR中的表达当内皮细胞受损和血-视网膜屏障被破坏后，血小板聚集在受损血管处，这在一定程度上可修补被破坏的血-视网膜屏障。在糖尿病患者及大鼠的视网膜中都能发现血小板微血栓，并且在空间上与内皮细胞凋亡有关[25]。血小板的聚集与DR中Fas/FasL的表达一致。在糖尿病中白细胞表达的FasL与内皮细胞的凋亡密切相关。有实验结果显示，在体内阻断FasL的表达可以抑制内皮细胞的损伤、血管渗漏、血小板聚集，意味着Fas/FasL系统是内皮细胞受损与血小板聚集的原因[26]。虽然视网膜内皮细胞的凋亡是DR的主要标志，但是糖尿病如何导致血管内皮细胞受损及凋亡的机制却不甚清楚，可能与FasL、IL-1β等增多有关。

2.4 caspase在DR中的表达caspase家族包含14种半胱氨酸蛋白酶，与凋亡密切相关[27]。caspase可根据同源的序列分为3个亚族：caspase-1(前体ICE家族)、caspase-2(ICE同源物ICH-1)家族、caspase-3(半胱氨酸蛋白32即CPP-32)。不同的caspase家族成员参与至少1～2个不同的信号通路，如促炎症因子的激活和促细胞的凋亡。其他如caspase-2，-6，-7，-8，-10是促进和执行凋亡的因子。有研究证明caspase在糖尿病、半乳糖喂养的大鼠和糖尿病患者的视网膜中均可检测到。通过免疫组织化学检测出糖尿病患者的视网膜节细胞层中有caspase-3，caspase-9，Bax，Bad和Fas[9,27-29]。Li等[30]发现用STZ诱导糖尿病大鼠后2wk即可发现视网膜中caspase-3的含量有所增加，在节细胞、神经纤维层、外光感受器层的含量最高。

2.5 DR与细胞凋亡信号的转导当来自于细胞外的细胞凋亡诱导因素作用于细胞后转化为细胞凋亡信号，通过胞膜相关受体将凋亡信号传导入胞内，再通过级联反应激活胞内凋亡信号通路，诱导视网膜细胞凋亡。目前为止，较为明确引发DR凋亡的机制主要与三条通路相关：死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路。

死亡受体介导的凋亡通路又称为外凋亡通路。所谓的死亡受体，即细胞膜表面的某些蛋白质，它们能与携带凋亡信号的专一性配体结合，并迅速将凋亡信号转导至细胞内而诱导细胞凋亡。目前，已发现20多个成员被认定为死亡受体，主要有肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、Fas分子(cD95/AP01)、死亡受体3(DR3，WSL-l，TRAMP，LARD)、DR4和DR5(AP02，TRAIL-R2，TRICK，KILLER)。Fas分子的配体为FasL，TNFR1的配体为TNFα，DR3的配体为AP03L。这些蛋白和细胞表面死亡受体如Fas，TNFR，DR3-5结合，使受体三聚化并活化，三聚化的死亡受体通过死亡域(death domain，DD)募集衔接蛋白如TRADD和(或)FADD。衔接蛋白通过死亡效应域(death effecter domain，DED)与procaspase-8形成死亡诱导信号复合物。Procaspase-8具有弱的催化活性，可发生自我剪接并活化，然后释放到胞浆并启动caspase-8的级联反应，激活下游的效应caspase如caspase-3、6和7，导致细胞凋亡；活化的caspase-8同时能激活Bcl-2家族的促凋亡因子Bid(binding interface database)，形成一种截短的Bid(truncated Bid，tBid)，后者转移到线粒体，破坏线粒体膜的通透性，从而诱导细胞色素C(Cyto-C)释放进入胞浆，进而激活死亡受体通路和线粒体通路，有效地扩大了凋亡信号。Crosby-Nwaobi等[31]通过对380例DR患者的血样分析发现，TNF-α在PDR患者中明显升高，许多研究同样能证明这个观点[32]。在高糖或氧化应激环境下，TNF-α与死亡受体结合后激活胞内Fas相关死亡结构域蛋白和TNFR1相关死亡结构域蛋白，激活caspase-8和c-Jun氨基末端激酶，从而诱导细胞凋亡[33-34]。此外，Huang等[35]对基因敲除TNF-α的小鼠研究发现，TNF-α在血-视网膜屏障的最后一道屏障中起着至关重要的作用。也有越来越多的研究表明死亡受体通路在DR中的重要作用。Wang等[36]研究证明Fas/FasL能导致细胞的凋亡，且随着糖基化终末产物的堆积，Fas-FasL信号通路可以诱导caspase-8的产生，促进细胞色素C的释放，进一步诱导caspase-3的产生，导致细胞凋亡。Valverde等[37]研究发现，抑制Fas/FasL死亡受体信号通路可能会成为对抗DR的新兴治疗方案。

线粒体通路又称为内凋亡通路，是众多细胞凋亡信号转导途径中最重要的途径之一。此通路与线粒体膜通透性改变有密切关系，主要由死亡受体非依赖的凋亡诱导信号(如射线、化疗药、微生物、细胞因子和生长因子缺乏等)启动。一般认为氧化应激所致的损伤可作用于线粒体通透性转换孔，导致线粒体膜的通透性增高，促使线粒体释放凋亡启动因子，从而导致细胞凋亡。而在此过程中，起主要调节作用的是Bcl-2家族，由于研究证明当线粒体功能紊乱时Bcl-2和Bcl-XL的含量均会降低，而促凋亡的Bax含量会增加，Bcl-2与Bax的相对含量决定了细胞凋亡的启动[38]。在高血糖状态下，Bax含量增加、线粒体膜通透性增高，caspase-9的前体及细胞色素C从线粒体中释放，它们所构成的凋亡酶激活因子1能够促进caspase-9及caspase-3的激活。

内质网是除原核细胞及成熟的红细胞外，普遍存在于所有真核细胞，其分布也并非仅仅局限于内胞质区域，还常常扩展到靠近细胞膜的外胞质区域。内质网是细胞内生物大分子物质如脂类、蛋白质等合成的场所。内质网可以介导凋亡通路，当各种应激因素导致内质网稳态被打破，使过多的未折叠或错误折叠蛋白在内质网蓄积时，将引起内质网应激(ERS)。为减轻应激，内质网将启动一个在进化上保守的信号级联反应即未折叠蛋白反应(UPR)。UPR通过减少蛋白翻译、上调分子伴侣表达和降解未折叠蛋白，以调节、恢复内质网的功能。如果过度的应激使内质网功能严重受损，则细胞常发生凋亡。内质网中过多蛋白的积累或钙平衡的破坏，可以引起内质网压力增高导致细胞凋亡。有研究通过检测STZ诱导的早期糖尿病大鼠视网膜中不同的氧化应激生物标记的含量，发现网状应激蛋白CHOP增多，CHOP是ERS时促凋亡的重要信号分子，并证明内质网应激是DR发病早期的重要机制[39]。

大量的证据都证明，细胞凋亡参与到DR的神经细胞的损伤，然而高血糖和相关的氧化应激下的具体病理机制却是未知的。在视网膜神经节细胞中发现这些促凋亡因子存在，暗示了这些物质在糖尿病视网膜神经退行性疾病中起着关键作用，这促使了在对视网膜神经细胞凋亡的进一步研究中寻找并确定关键因子，为打破视网膜神经萎缩的级联病理反应提供可能性。糖尿病所致的视力损害成为一个日趋严重的世界问题，随着对DR中细胞凋亡及其相关基因的进一步深入研究，可能为DR的临床药物治疗提供新的治疗靶点或思路。

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Research progress of diabetic retinopathy and apoptosis-relating genes

Pei-Yan Han，Hong-Bin Lü

Department of Ophthalmology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Correspondence to:Hong-Bin Lü. Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China. oculistlvhongbin@163.com

Received：2016-01-12Accepted：2016-04-06

Abstract
•Researches have shown that cell apoptosis participates pathogenesis of diabetic retinopathy, which is a process of polygenes regulation. The B-cell leukemia/lymphoma-2(Bcl-2) family and Fas are all important genes that can regulate apoptosis. This article reviews the relation between diabetic retinopathy and apoptosis as well as expression of some related genes.

KEYWORDS:•diabetic retinopathy;apoptosis;B-cell leukemia/lymphoma-2;cytoine

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.5.17

收稿日期：2016-01-12 修回日期： 2016-04-06

通讯作者：吕红彬，博士，主任医师，教授，研究方向：玻璃体视网膜疾病.oculistlvhongbin@163.com

作者简介：韩佩晏，在读硕士研究生，研究方向：玻璃体视网膜疾病。