刘　娜 综述，闫卫利 审校

(天津中医药大学第二附属医院　300150)



·综述·

内皮微粒检测在慢性阻塞性肺疾病诊疗中的应用

刘娜 综述，闫卫利 审校

(天津中医药大学第二附属医院300150)

内皮微粒；慢性阻塞性肺疾病；CD144；CD31；CD62E

血管内皮细胞是衬覆于血管内壁的单层扁平细胞，在保持血管内膜完整性和维持血管正常功能方面具有重要作用[1]。微粒(MPs)是细胞脱落的小囊泡，来源于血小板、红细胞、白细胞及内皮细胞。它表达大量的细胞表面标志，富含mRNA，与多种生物学行为有关[2]。它包含了前体细胞特有的细胞膜、细胞质和细胞核结构，在大小和组成上与其他亚细胞结构如凋亡体和外染色体不同，且功能各异。几乎所有类型的细胞都能释放MPs。有研究表明，内皮微粒(EMPs)不仅是内皮功能紊乱的新的标志物，并被认为在炎症、血管损伤、内皮功能障碍中发挥着重要的生物学作用。心血管、代谢、肺部疾病患者血液中EMPs水平均升高，而EMPs水平升高反映这些疾病内皮损伤严重程度[3]。本文首先回顾MPs的起源，重点探讨EMPs与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的关系，总结血浆EMPs的检测方法。

1　MPs的起源

MPs存在于血浆中，直径为0.1～1.0 μm，是富含磷脂的细胞膜颗粒。1967年，Wolf[4]发现来自活化血小板膜脱落颗粒，命名为血小板尘埃。1986年，Wagner等[5]在镰刀形红细胞病、遗传性红细胞增多症患者中相继发现了来源于红细胞的MPs。1994年，Satta等[6]证实单核细胞在细菌脂多糖刺激下释放颗粒。1999年，Combes等[7]用肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激脐静脉内皮细胞能使其释放EMPs。随后就MPs释放机制的研究表明，细胞活化过程中，胞内钙离子流增加，磷脂爬行酶激活，翻转酶激活，致使膜磷脂重新分布，导致磷脂酰丝氨酸由膜内层迁移至外层，钙离子流增加还可引起细胞收缩和细胞支架重建，细胞外形改变、出芽，这些隆起的泡状物挤压胞膜并脱落，脱落的细胞MPs整合了一部分细胞膜表面蛋白和其他成分，而MPs内容物多为核苷酸类如mRNA、小RNA，蛋白水解酶如金属蛋白酶、凝血活酶等[8]。MPs在细胞生物功能调节方面的作用可概括为MPs与靶细胞表面的特殊受体结合，通过细胞的胞吞过程，将这些小分子物质和RNA转移入靶细胞中。

2　近年研究热点

EMPs是近年提出的反映内皮功能障碍的生物指标，表面表达磷脂酰丝氨酸和内皮细胞特征性的表面抗原，分为血小板内皮细胞黏附分子CD31、玻连蛋白CD51、钙连蛋白CD144、黑色素瘤细胞黏附分子CD146、E选择蛋白CD62E等5种。

2.1钙连蛋白CD144钙连蛋白CD144仅表达于内皮细胞，是特异性最强的标志物，其他4种EMPs在血小板、中性粒细胞、淋巴细胞、黑色素瘤细胞上也有表达。钙连蛋白的脱落，常伴随中性粒细胞的迁移以及血管渗透性的改变。钙连蛋白CD144的升高，不仅表明炎症的发生，而内皮细胞的结构也被破坏。

2.2血小板内皮细胞黏附分子CD31血小板内皮细胞黏附分子CD31有调节血小板功能，参与血管生成，以及T细胞、B细胞的激活。有实验证明血小板内皮细胞黏附分子由肺微血管内皮细胞释放，与过氧化氢或吸烟的刺激有关[9]。另有研究报道，90% COPD患者和60%吸烟者血小板内皮细胞黏附分子CD31表达锚定蛋白V,通过检测锚定蛋白V，从而反映受损内皮细胞的凋亡。

2.3黑色素瘤细胞黏附分子CD146黑色素瘤细胞黏附分子CD146，参与内皮细胞的信号传导、细胞迁移、血管生成、免疫应答[10]。

2.4E选择蛋白CD62EE选择蛋白CD62E在炎症刺激后数小时被激活，招募白细胞至感染部位，反映了炎症的进展程度。E选择蛋白CD62E在相应细胞的静止状态下有一定水平的表达，在某些因素的作用下，可发生上调或下调。

2.5玻连蛋白CD51玻连蛋白CD51是整合素的α链，也是玻璃粘连蛋白受体的α链，在内皮细胞来源特异性方面低于上述4种EMPs[11]，但在白细胞的归巢过程中起一定的作用。

3　EMPs与COPD的关系

3.1COPD的发病机制和肺功能测定的局限性COPD是一种破坏性的肺部疾病，是以不完全可逆的气流受限为特征的疾病，气流受限通常呈进行性发展，并与肺对有害颗粒或气体的异常炎性反应有关。目前认为，氧化应激是引起COPD发生、发展的重要机制之一。氧化应激不仅直接损伤肺组织，还可通过激活核因子κB和丝裂原活化蛋白激酶等信号通路上调炎症基因表达，引起肺内炎性反应，而炎性反应又可产生大量活性氧，加重肺氧化损伤，从而促进COPD病情的发生、发展[12]。氧化应激中H2O2增多引起内皮细胞凋亡和肺毛细血管内皮细胞释放CD31+、CD144+EMPs[9]，二者升高提示COPD急性加重。而COPD急性加重又进一步导致肺毛细血管内皮细胞损伤，从而使二者血浆水平进一步升高。现阶段诊断和评估COPD病情时,肺功能测定可作为一项金标准,能客观测定气流阻塞的程度，其中第一秒用力呼气容积占用力肺活量百分比(FEVl/FVC)，可检出轻度气流受限。第一秒用力呼气容积(FEV1)占预计值的百分比(FEV1%预计值)是中、重度气流受限的良好指标，二者变异性小，易于操作，是目前COPD肺功能检查的基本项目。FEVl/FVC<70%,且在应用支气管扩张剂后FEV1%预计值<80%时,可肯定患者有气流阻塞且不能完全逆转。然而其有两点局限性：首先，FEV1敏感性并不高。其次，FEV1的降低不能区分是疾病的频繁加重还是支气管的高反应性。再次，COPD的临床表现和放射学变化多样，但往往气流受限的程度用FEV1来评价却是相同的，导致对COPD病情的评估可能会滞后，因此用于评价COPD的新的生物学标志物有待于发现和应用。

3.2EMPs与COPD稳定期、急性加重期、肺功能损伤的关系有研究报道，与戒烟对照组相比，COPD稳定期患者，钙连蛋白、血小板黏附分子、E选择蛋白水平显著升高；COPD加重期患者，E选择蛋白水平显著高于非频繁发作的COPD稳定期患者[13]，表明E选择蛋白的水平反映了内皮细胞炎症的进展。COPD加重期，钙连蛋白、血小板黏附分子和E选择蛋白水平显著升高。除此之外，COPD的加重与肺气肿有关，而肺气肿又与肺毛细血管的损伤密不可分。加重期钙连蛋白、血小板黏附分子和E选择蛋白的升高趋势并不相同，28 d后，钙连蛋白、血小板黏附分子仍继续升高，表明临床症状消失后内皮仍处于损伤状态;E选择蛋白却逐渐降低，这与血浆纤维蛋白原的变化很相似。然而，有研究表明，COPD稳定期玻连蛋白CD51和E选择蛋白的升高却没有统计学意义(P>0.05)，血小板黏附分子升高有统计学意义(P<0.05)。E选择蛋白在COPD加重期升高显著，稳定期变化不明显。

上述两份研究还探讨了EMPs和肺部功能损伤的关系，结果表明，血小板黏附分子、E选择蛋白、钙连蛋白与FEV1占预计值的百分比呈负相关。Liu等[14]研究发现，COPD模型大鼠较健康组CD31+/CD42b-EMPs水平升高，增高的EMPs来源于肺血管内皮细胞凋亡，其用力0.3 s呼气量/用力肺活量则下降，预示EMPs可作为COPD大鼠肺功能损害严重程度及肺血管内皮细胞损害及凋亡的潜在生物学指标。但增高的EMPs在COPD急性加重期中的具体作用机制尚不明确，可能与其在急性加重期引起肺血管内皮细胞功能障碍及损伤和加重炎性反应等相关。

4　EMPs的检测

如今对EMPs的检测应用最为广泛的实验技术为流式细胞术(FCM)，根据研究目的加入荧光素标记的高特异性抗体结合EMPs表面特异性抗原，如CD31+、CD144+、CD146+、CD62E+等，但多数表面抗原不是EMPs所特有表达的，且不同FCM对EMPs灵敏度不一致，还受波长限制，直径小于0.3 μm EMPs难以被检出[15-16]。新式流式细胞仪可分辨更小的EMPs，检出EMPs数更高[17-18]。标本的前处理主要是采用离心法去除血细胞提取EMPs，优点是降低了底物干扰，限制了母细胞释放新的EMPs，阻止冻融造成的细胞碎片。二次离心后得到血小板血浆能减少50%～80%的EMPs。高速离心和冲洗将EMPs从血浆中分离出来，去除未结合的抗体和其他用来检测EMPs表面抗原的探针类物质。值得一提的是，离心方法比如转速、时间、方式都可能影响EMPs的检测数量，急切需要建立一套标准化的操作程序来提高检测的可比性。

酶联免疫吸附试验(ELISA)也可用于EMPs的检测，但应用受限，其原理是利用锚连蛋白V与磷脂酰丝氨酸之间的亲和力，固定锚连蛋白，捕获血浆中EMPs进行检测。ELISA测定EMPs相对FCM虽具有对弱抗原敏感性高、不受EMPs大小限制、一次性可完成大量标本检测等优点，但非定量，且对体积不能确定，限制了ELISA的应用，且与其结合的抗体性质易变、易受可溶性抗原干扰及不能定量等缺点。此外标本储存时间和方式、处理方式、不同检测方法等均会影响EMPs检测结果，这些问题均值得探讨[19-22]。

5　小　　结

本文总结了EMPs作为一个新的COPD标志物在指示疾病进展的相关研究，展望了EMPs的检测前景，也许通过EMPs亚型的差异能够重新对COPD的病情进行评估。

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