纪志华，钟贞浩，孟志斌

(海南医学院附属医院骨科，海南 海口 570102)

LIM矿化蛋白-1发挥成骨效应的机制探讨

纪志华，钟贞浩，孟志斌

(海南医学院附属医院骨科，海南 海口 570102)

近来大量研究证实，LIM矿化蛋白-1(LMP-1)是一种细胞内骨架蛋白，属于PDZ-LIM蛋白家族，参与细胞成骨分化的早期阶段；其不同结构域各有其独特的作用，它们可通过招募多种成骨因子、促进细胞增殖、上调成骨相关基因表达、减少炎性骨丢失等多种途径发挥其促成骨效应。LMP-1可通过其不同结构域的协同作用发挥强大的促成骨效应。本文对LMP-1发挥成骨效应的机制探讨作一综述。

LIM矿化蛋白-1；结构域；成骨分化；机制

LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1，LMP-1)是一种细胞内骨架蛋白，属于PDZ-LIM蛋白家族[1]。PDZ-LIM蛋白家族以它们结构中的PDZ和LIM结构域为特征，因其结合了两个功能结构域，使其对细胞发育及内环境的稳定具有广泛的作用[2-3]。LMP-1在N端和C端分别由在进化上高度保守的一个PDZ结构域和三个LIM结构域构成，两端的结构域之间的区域为独特区[4]。越来越多的证据表明，LMP-1作为一种细胞内非分泌蛋白，其在调控骨形成及骨分化方面起到重要作用，但其确切的成骨机制各有见解，至今仍未达成一致共识。本文检索近年来有关LMP-1在成骨效应及其分子机制方面的文章，从PDZ-LIM蛋白家族的分子结构出发，分析LMP-1的结构特点与其成骨效应的相关性，并进一步对其成骨效应的分子机制作一归纳分析。

1 PDZ-LIM蛋白家族

PDZ-LIM蛋白家族所有成员都由一个PDZ结构域及至少一个LIM结构域组成[5]。PDZ结构域由80～100个氨基酸组成，其命名来源于最早发现含有此结构域的三个蛋白质(PSD-95，DLG及Zo-1)首字母的缩写[6]。LIM结构域是由半胱氨酸和组氨酸重复出现形成的锌指结构在Lin-11、IsI-1和Mec-3这三种同源蛋白中发现，故把含有这种结构的蛋白统称为LIM结构蛋白[7-8]。在PDZ-LIM蛋白家族中，PDZ和LIM结构域主要起支架作用，通过与纤丝状肌动蛋白的相关蛋白、各种胞质信号分子及胞核蛋白结合发挥其广泛作用[9-12]。在PDZ-LIM蛋白家族的进化过程中，某些结构域发生拷贝与重排，便产生了功能各异的亚家族及某些独特的蛋白，如ALP亚家族ALP、Clp-36/Elfin、Mystique及RIL、Enigma亚家族Enigma/ LMP，Enigma Homolog和Cypher/Zasp、LMO-7、LIM激酶亚家族LIMK-1和LIMK-2[5]。所有的家族成员都可以通过与肌动蛋白细胞骨架相互作用而发挥其生物学作用[12-13]。其中ALP、Enigma亚家族和LMO-7可以通过它们的PDZ结构域结合α-辅肌动蛋白[14-16]。Zasp和ALP在肌肉及心脏的发展中起到重要的生物学作用[17-18]，Enigma则在骨的形态发生中起到了尤为重要的作用[19]，而LIM激酶亚家族在神经系统及生殖细胞的发展中发挥重要作用[20-21]。此外，LMO-7和Mystique、RIL、LIM激酶亚家族都与肿瘤的发生及转移有密切联系[22-24]。

2 LMP-1 的结构特点

LMP-1属于PDZ-LIM蛋白家族中的Enigma亚家族，它是由Boden等[19]在研究糖皮质激素对成骨细胞的分化影响时发现的一种新的蛋白质分子。Boden等[19]通过差异显示多聚酶联反应比较糖皮质激素刺激和未刺激培养的小鼠传代成骨细胞mRNA差别后，得到全长1 696 bp的cDNA片段，其中1 374 bp的翻译区编码一个新的457个氨基酸的蛋白质，它就是LMP-1。之后人类陆续发现有3种不同的LMP剪接变异体：LMP-1、LMP-2和LMP-3。其中，LMP-1由N端的一个PDZ结构域和C端的三个LIM结构域构成，而PDZ和LIM结构域高度保守，但它们在两端的结构域之间的区域形成独特区，对LMP-1发挥成骨效应发挥必不可少的作用[25-26]。LMP-2在独特区的325 bp和444 bp之间缺失了119 bp，而在444 bp处插入了17 bp，最终形成的蛋白长度为423个氨基酸，但它有完整的PDZ和LIM结构域。LMP-3则在444 bp处插入了17 bp，由于这导致了读码框的转变，故在505～507 bp出现了一个终止子，最终形成的蛋白长度为152个氨基酸，它虽有完整的PDZ结构域，但丢失了约30%的独特区而且没有LIM结构域[27]。

3 LMP-1 的成骨效应及其分子机制

3.1 LMP-1参与成骨分化的早期阶段 LMP-1作为一种细胞内信号分子，直接参与成骨细胞的分化。在体外实验中，诱导骨髓间充质干细胞、颅盖骨成骨细胞、表皮成纤维细胞中LMP-1的表达并促进骨谱系细胞的分化。而在体内，通过转染LMP-1基因能发现高效异位皮下及肌肉内及原位脊柱融合及骨折愈合骨形成[25,28-29]。Lin等[30]在研究牙周膜细胞的成骨分化时发现，LMP-1在其成骨分化的早期阶段上调。另外，Boden等[19]研究发现，在胚胎骨的发育过程中，软骨始基中心成骨细胞出现前，就可在肥大的软骨细胞附近的间充质细胞中发现LMP-1的转录物，这也提示LMP-1与早期成骨细胞分化相关。而Barnes等[31]通过组织原位杂交研究也提示了LMP-1均于软骨内成骨和膜内成骨的早期阶段表达。

3.2 LMP-1与成骨因子协同作用促进成骨 Sangadala等发现LMP-1可以与Smad 1/5竞争性结合Smurf 1-WW2结构域，有效地减少了Smurf 1介导的Smad 1/5泛素化及降解，促进细胞对BMPs敏感性的增加因而有效地促进了成骨分化。此外，作者发现LMP-1独特区中的WW2结构域-作用位点是其与Smad 1/5竞争性结合Smurf 1并发挥成骨诱导作用的关键位点[32-33]。Kato等[34]根据以上机制，通过用一种低分子量的复合物SVAK-12作用于成肌细胞性的C2C12细胞，因为它能与Smurf 1-WW2结构域结合，从而替代了LMP-1，发挥了增强细胞对BMP-2反应性的作用。作者通过检测BMP特异性指示物、BMP-2诱导的骨钙蛋白及碱性磷酸酶的mRNA的表达，证实SVAK-12起到促进C2C12成肌细胞向成骨分化的作用，这也大大减少了临床治疗时使用BMPs促进骨生成的剂量。LMP-3作为LMP-1的变构体的有完整的PDZ结构域，而没有LIM结构域，但其同样在独特区中含有WW结构域-作用位点。但有体外研究证实，转染LMP-3表达质粒到成骨细胞中可检测到，其有与hLMP-1类似的诱导骨形成的作用[35-36]。与LMP-1及LMP-3不同的是，LMP-2虽然有完整的LIM结构域，但却没有骨诱导作用。这表明，LMP-1可通过抑制Smad 1/5的降解而协同成骨因子BMPs发挥其促进成骨作用，且通过与LMP-2及LMP-3比较分析表明，LMP-1独特区的WW结构域-作用位点在其成骨诱导作用中是不可或缺的，而非LIM结构域。

3.3 LMP-1通过促细胞增殖间接促进成骨 Lin等[30]发现用完整长度的LMP-1基因转染PDL细胞具有多向分化潜能包括成骨分化的祖细胞能够增强PDL细胞的增殖，采用RNA干扰使LMP-1沉默时，则抑制了PDL细胞的增殖。而用切除了LIM结构域的LMP-1即仅含有PDZ及WW相互作用结构域转染PDL细胞时，其显著减弱了促进PDL细胞增殖的效果，这表明PDZ及WW结构域-作用位点不足以诱导LMP-1的促丝裂原作用及接下来的分裂增殖，即LIM结构域在促进细胞的增殖作用中起到关键作用。类似地，有研究表明，LMP-1可发挥其作为骨架蛋白的作用，它可调控由生长因子活化的丝裂原信号的转导途径。Durick等[37]发现在鼠10T1/2成纤维细胞中，LMP-1通过Ret/ptc2调控丝裂原信号通路，并通过其第二个LIM结构域结合到Ret/ptc2上，而它的PDZ结构域则将LMP-1-Ret/ptc2复合体锚定到细胞的外围结构。另外，研究者发现倘若切除了LIM结构域的LMP-1的表达，则会抑制Ret/ptc2的促丝裂原作用。由此可见，LMP-1蛋白可通过促进细胞的增殖，从另外一方面间接地促进了成骨效应。其中，LMP-1蛋白的LIM结构域起着特异性结合丝裂原相关调控蛋白并起了分裂增殖的作用。

3.4 LMP-1可上调成骨相关基因的表达及成骨因子的合成 Boden等[19]在1998年就阐述了LMP-1可上调BMP-6等多种细胞因子的表达。Komori等[38]发现通过转移LMP-1基因后，细胞BMP-2和核结合因子α1(Core Binding Factor α1，CBFα1)，即RUNX2基因的表达及蛋白质的合成明显增加。其中，BMP-2是促成骨诱导分化能力最强胞外蛋白，而RUNX2则是成骨细胞分化关键的调控转录因子。Minamide等[39]在体内外研究中发现转染LMP-1可诱导A549细胞上调多种BMPs，如BMP-2、4、6、7和TGF-β1转化生长因子-β1的表达，并进一步促进骨形成。与LMP-1类似，LMP-3也可以通过上调成骨相关因子的基因表达和蛋白合成而实现促成骨作用[40]。Pola等[35]用LMP-3转染NIH3T3及MC3T3-E1细胞时发现，成骨特异性基因如骨钙蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸糖蛋白基因的表达上调，且这与用BMP-2表达质粒转染NIH3T3或MC3T3-E1细胞时具有相似的效果。LMP-1与LMP-3可通过上调多种成骨相关基因的表达及蛋白的合成进而促进成骨分化。已知LMP-3有完整的PDZ结构域，独特区中含有WW结构域-作用位点，而没有LIM结构域。因此，我们认为LMP-1通过此途径促进成骨作用可能与其PDZ结构域和或独特区的功能有关，但确切的生物学机制尚需进一步研究。

3.5 LMP-1能抑制NO的生成而减少炎性骨丢失 Liu等[41]发现LMP-1在前破骨细胞、巨噬细胞中可通过抑制NF-κB的活化及选择性调控丝裂原活化的蛋白激酶MAPK通路，导致了NO的生成减少而起到抗炎症效果，从而减少炎性骨丢失，这从另一方面阐明了LMP-1的成骨机制。作者在经LPS脂多糖刺激的RAW264.7前破骨细胞中发现，LMP-1通过抑制iNOS基因的表达、NF-κB的转录活性及核转位、IKB (Inhibitor of Kappa B)的磷酸化从而显著减少NO产生量。而作者在对照组中，LMP-2则不能抑制iNOS基因的表达。由此可见，LMP-1中的独特区通过抑制NO生成而起到了减少炎性骨丢失的作用。

4 展望

LMP-1是由N端的一个PDZ结构域和C端的三个LIM结构域构成，正是由于其特殊的结构特点，决定了其广泛的生物学作用。已有研究表明，PDZ和LIM结构域各自发挥着自己的作用，而它们之间又相互协调。其中，LIM结构域与具有特定生物学活性的蛋白结合形成复合物，而PDZ结构域则将该复合物结合至肌动蛋白微丝并由后者转运至特定的区域发挥作用。同样，在此我们通过分析文献也可发现，无论是LMP-1其N端的PDZ结构域，或是处于独特区的WW结构域-作用位点，还是C端的LIM结构域，对其发挥成骨效应都起到独特的作用。其中，独特区的WW结构域-作用位点对其发挥协同BMPs促成骨作用必不可少；LIM结构域则在促进细胞的有丝分裂及增殖方面起关键作用，这也间接地促进了成骨效果；而PDZ结构域则作为介导蛋白之间相互作用的重要结构域之一，更广泛地参与蛋白在细胞内的运输及各种信号通路的传导过程，并对细胞成骨分化有着影响。

综上可知，LMP-1在成骨方面具有巨大的潜能，随着分子生物学及组织工程技术的不断发展，对LMP-1结构功能的研究不断深入，相信在不久的将来，LMP-1的成骨作用机制将被阐明，其将更广泛的应用于临床治疗领域并将发挥至关重要的作用。

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R329.2+6

A

1003—6350（2016）15—2507—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.033

2015-06-23)

孟志斌。E-mail：zhongzhenhao2011@163.com