李淑珍 武飞 陈月林 杨颖

【摘要】目的：对沙棘叶总黄酮的提取工艺进行优化。方法：采用溶剂浸提法提取沙棘叶总黄酮，利用分光光度法测定总黄酮的含量，正交试验进行优化。结果：取7月份沙棘叶粉碎物，过35目筛，经正交实验优化后的提供工艺为：用60%的乙醇作溶剂，固液比为1∶20，在80℃提取30min，用此方法100g叶粉碎物经提取可得8.71g粗制品，总黄酮提取率达0.14%。结论：上述工艺操作简单、方法可靠，产品得率高，提取性能较好，适合于沙棘总黄酮大规模提取。

【关键词】沙棘叶；总黄酮；提取工艺；正交试验

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）01-0014-03

沙棘（Hippophe rhamnoids L.）属胡颓子科沙棘属植物，又名醋柳，被国际医药学家和营养学家誉为人类21世纪最具发展前途的医药及营养保健植物。其根、茎、叶、果实等都含有维生素、黄酮类化合物和丰富的矿物质元素等，为药食同源植物，并广泛应用于食品、医药、化妆品等多个领域[1]。沙棘1977年收载于《中华人民共和国药典》，所含的黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、降血糖、保护心血管等多种生物活性[2-3]。内蒙古沙棘资源具有分布广、种植面积大、果实质量高等特点，对沙棘产业的发展十分有利。且沙棘作为防护林发挥着巨大作用，种植面积也逐年增加。而沙棘果实黄酮的开发已经报道很多[4-5]，从叶中提取黄酮类化合物也具有原料来源广泛、成本低廉的优势[6]。研究从沙棘叶提取黄酮，旨在筛选适合沙棘叶黄酮的提取工艺，获取高含量的总黄酮，促进沙棘资源的综合利用。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 722可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；DZKW-S-8电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；RE-52旋转真空蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；101-2型数显电热鼓风恒温干燥箱（上海阳光实验儀器有限公司）。

1.2 材料 沙棘叶采于内蒙古乌兰察布市（集宁区）卓资县郊野，经杨鸿飞教授鉴定沙棘（Hippophe rhamnoids L.）的叶。并将其充分粉碎，过35目筛，置于干燥器中备用。芦丁对照品（批号：100080-201407，中国药品生物制品检定所）。其他试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 沙棘叶总黄酮含量的测定

2.1.1 标准曲线的制作 准确称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用70%的乙醇溶解并定容至100ml，使其浓度为200μg/ml。分别取10、15、20、25、30、35、40、45ml，用70%的乙醇定容50ml，即为40、60、80、100、120、140、160、180μg/ml的芦丁溶液。各取1ml于试管中，加70%的乙醇1ml，加入0.5ml 5%的NaNO2，混匀后放置6min；然后加入0.5ml 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀后放置6min；最后再加入6ml 4%NaOH，放置15min，在510nm处测定不同浓度标准品的吸光值（亚硝酸钠-硝酸铝比色法）。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标绘制芦丁标准曲线。得回归方程：Y=477.38X-2.261（R=0.9979），结果表明芦丁在0～120μg/ml浓度范围内呈良好线性关系。

2.1.2 样品中黄酮含量的测定 取一定量的沙棘叶黄酮样品，配制成样液。再取一定量总黄酮样液，定容至某一体积。各取1ml于试管中，采用“2.1.1”项比色法测定吸光值，计算总黄酮含量。

X=Y×V×n×100%/m。

式中，X为样品中总黄酮含量，Y为样液中总黄酮浓度（mg/mL），由回归方程可算得；V为样液体积（mL）；n为稀释倍数；m为样品量（mg）[7]。

2.2 提取条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择 取8份过35目筛的6月份沙棘叶粉碎物各1g，分别加入甲醇、乙醇、水、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇10ml，在70℃水浴加热提取10min，过滤。用70%乙醇统一定容到50ml，各取1ml于试管中，采用2.1.1项比色法测定吸光值，计算提取率。同样方法做3次平行试验，确定提取的最佳溶剂，结果见图1。

由图1可知，沙棘总黄酮在甲醇、乙醇、水等极性溶剂中溶解度大，提取率高；在氯仿、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂中溶解度小，提取率低。在所测溶剂中，甲醇最好，但甲醇有毒，给操作带来不便。由于乙醇具有、无异味、无残留、安全性好等优点，且容易回收，故选用乙醇为提取溶剂。

2.2.2 提取原材料的选择 取5份过35目筛的5～9月份沙棘的叶粉碎样品各10g，加入50%乙醇150ml，在70℃水浴加热提取30min，过滤，蒸发乙醇，用50%乙醇定容到100ml，稀释取5ml定容到50ml的容量瓶中，取1ml于试管中，测定吸光值，计算总黄酮含量，选择最佳提取原材料。

黄酮化合物是植物生理过程中的次生代谢产物，这些物质的往往受到植物发育阶段酶的调节和遗传机制的控制。不同发育阶段黄酮化合物含量不同。由图2可知，5月份日照时间长，植物正处在生长的旺盛阶段，故5月份黄酮含量高；随后植物生长变缓，合成量减少或转化为其他物质，故含量下降。但西北地区5月份叶子处于发芽阶段，产量低，不宜选用。7月叶子已经长成，也未结果，又出现了黄酮含量的高峰，不宜用7月份叶作为实验原材料。

2.2.3 多因素正交试验 在单因素筛选的基础上，设计多因素试验表，见表1。取7月份叶粉碎样品1g，按照下列正交试验条件进行提取、过滤，用70%乙醇统一定容至30ml。各取1ml于试管中，测定吸光值，计算总黄酮含量，确定优化后的提取条件。

多因素正交试验结果见表1，直观分析得出：叶中提取总黄酮的影响因素的顺序是：C>B>A>D，即提取温度>固液比>乙醇浓度>提取时间，优化组合后的提取因素的选择为A2B2C3D1。方差分析的结果见表2，影响提取沙棘总黄酮各因素均为极显著因子（P<0.01）。综合考虑最佳的提取条件为A2B2C3D1，即取7月份叶，用60%的乙醇作溶剂，固液比为1∶20，在80℃提取30min，提取效果较好。

2.3 沙棘总黄酮的得率和含量测定 准确称量沙棘7月份叶粉碎物100g，按上述确定的优化提取条件进行浸提，将浸提液在60℃减压浓缩回收乙醇，将浓缩液在60℃的干燥箱干燥，称量干燥粗制品的质量，得到粗黄酮产品得率。从中取1g用70%的乙醇溶液溶解，稀释一定倍数，取1ml测定粗制品总黄酮含量，结果见表3。

由表4可知，100g叶粉碎样品经此提取条件提取，可得到8.71g粗黄酮产品，叶粗制品黄酮含量达0.14%，并且RSD为0.68%，纯化后总黄酮含量达到14.89%，表明该工艺重复性强，稳定可靠，精密度高。

3 讨论

内蒙古沙棘资源具有分布广、种植面积大、果实质量高等特点，对沙棘产业的发展十分有利[8]。且沙棘作为防护林发挥着巨大作用，种植面积也逐年增加。有研究发现沙棘所含总黄酮为叶子（876mg/100g）>果渣（502mg/100g）>鲜果汁（365mg/100g）>鲜浆果（354mg/100g），说明从叶中提取黄酮具有重要意义[9]。对于从沙棘中提取总黄酮的方法，目前有超临界CO2流体提取、微波法提取、超声波法提取、有机溶剂提取、水浸提取等。超临界CO2萃取适用于非极性化合物的分离；微波法和超声波法提取仅限于少量提取实验，工业化大生产不宜应用。水浸提取沙棘总黄酮提取率偏低；有机溶剂提取中甲醇和丙酮含有毒成分，因此用乙醇提取沙棘黄酮是适合工业化生产的适宜方法[10]。该方法经实验优化，60%乙醇作为提取溶剂，提取30min，既节约时间，且乙醇还可以重复利用，无毒害无残留，适合工业化扩大生产。经优化工艺提取后所得叶黄酮得率为8.71%，相对较高，但黄酮含量（0.14%）较吕敏[11]采用正交试验法优选提取山西沙棘Hippophe rhamnoids L.叶总黄酮含量（4.82%）较低，这可能与不同品种的沙棘黄酮含量不同有关。王亚辉等[12]对内蒙古不同产区同一品种沙棘黄酮含量研究发现：内蒙古和林格尔县（2.5±0.07）%>内蒙古凉城县（2.3±0.02）%>内蒙古东胜区（2.2±0.08）%>内蒙古翁牛特旗（1.8±0.01）%>内蒙古敖汉旗（1.7±0.09）%>内蒙古集宁区（1.4±0.01）%。除集宁外，5个产区的总黄酮含量均达到《中国药典》标准（1.5%）。实验选用沙棘品种恰好来自集宁区卓资山县，提取原材料并非5月份含量最高季节采收，而是产量较高的7月份采收，原料只提取1次，而吕敏实验提取三次，所以该实验黄酮含量相对较低。与其他研究结果比较[13-15]，产品得率较高，并且该提取工艺操作简单、乙醇无残留可重复利用，适合于沙棘总黄酮的提取，可进行规模化生产。

参考文献

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（收稿日期：2015.09.23）