张璐璐， 严 兴， 赵 勇*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306;2.中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所合成生物学重点实验室，上海 201306;3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201306)

1型CRISPR位点间区序列分析在嗜热链球菌菌株分型中的应用

张璐璐1,3， 严 兴2*， 赵 勇1,3*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306;2.中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所合成生物学重点实验室，上海 201306;3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201306)

为了建立适用于嗜热链球菌菌株资源多样性调查的菌株分型方法，尝试将1型CRISPR位点间区序列分析用于嗜热链球菌的菌株分型，并与常用ERIC-PCR指纹图谱方法进行了比较。结果表明，1型CRISPR位点间区序列分析可以把30株从三个不同样品中分离的嗜热链球菌分成三种差异明显的类型：不同类型菌株之间没有相同的间区序列；而同一类型菌株之间，间区序列的组成和排列则基本一致，并且上述分型的结果与用ERIC-PCR指纹图谱技术获得的结果完全一致。因此，1型CRISPR位点间区序列分析是嗜热链球菌分型鉴定的可靠方法，并适用于大量菌株的分型鉴定和多样性调查。

嗜热链球菌；1型CRISPR位点；间区序列分析；ERIC-PCR指纹图谱；菌株分型

嗜热链球菌是发酵乳品工业中最为重要的乳酸菌之一，可以产生风味物质如乳酸、乙醛和丁二酮来调节酸奶风味[1]。同时，嗜热链球菌可以缩短酸奶的凝乳时间，增加酸奶制品的黏度，改善酸奶的后酸化现象[2]。此外，其益生特性可以增强酸奶的保健功能[3]。人们已经从传统发酵乳制品分离了大量的嗜热链球菌，对这些菌株进行分型，可以为乳品发酵工业提供更多菌株资源。目前，基于指纹图谱的分析方法是嗜热链球菌分型研究中最为常用的方法[4-6]，例如，随机扩增DNA多态性(random amplification of polymorphic DNA，RAPD)和扩增片段长度多态性(amplified fragment-length polymorphism，AFLP)等指纹图谱方法都已经被用于嗜热链球菌的菌株分型等。但是这些基于指纹图谱的分析方法具有很大的局限性。首先，指纹图谱的分析方法容易受到实验条件的影响，不同实验室得到的指纹图谱相互之间很难进行比较；其次，指纹图谱的分型方法也不易于对大量的菌株信息进行存储和比较[7]。多位点序列分型(Multiple loci sequence typing，MLST)是近些年出现的菌株分型的新方法。MLST通过对菌株的多个保守基因进行测序进而达到分型的目的，这是一种准确度高、重复性好的分型方法，但是因为需要对多个位点进行测序所以成本比较高。Yu等利用MLST的方法对从蒙古国和中国的18个地区发酵乳制品中分离的239株嗜热链球菌进行了分型。虽然通过MLST获得了可靠的分型结果，但是这种方法需要同时对嗜热链球菌的10个持家基因(carB、clpX、dnaA、murC、murE、pepN、pepX、pyrG、recA和rpoB)进行测序，然后再进行分型分析[8]，显得十分繁琐。规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs)是一类广泛分布于细菌和古细菌基因组中的重复结构[10-11]。CRISPR的结构特点是包括一段由不连续的同向重复序列(direct repeat，DR)间隔着28～32 bp的非重复间区序列(spacer)组成的区域。一般来说，同一个菌种CRISPR位点的同向重复序列绝大多数非常保守[12]， RNA稳定性预测证明同向重复序列倾向于形成短的回文结构, 该结构可能是CAS蛋白的识别标记[13]。Barrangou等发现CRISPR中的间区序列来源于侵染宿主的噬菌体[14]，因此间区序列具有很高的特异性，即使在同一物种的不同菌株间，间区序列也往往不同[15]，间区序列的高度变异性使它适用于同一菌种不同菌株分型的分子标记，它实际上反映了不同菌株对应环境的适应过程。在嗜热链球菌中发现了三种类型的CRISPR位点，其中类型1的CRISPR位点是所有嗜热链球菌都具有的。Bolotin等[16]、Horvath等[17]针对嗜热链球菌的1型CRISPR位点序列设计了保守引物，可以用于1型CRISPR位点的PCR扩增。由于CRISPR中间区序列的高度可变性，因此可以作为对嗜热链球菌进行菌株分型的理想分子标记。ERIC-PCR是一种基于长引物的随机扩增DNA多态性指纹图谱技术(LP-RAPD)，由于其引物比较长且PCR退火温度比较高，因此具有比RAPD指纹图谱更高的稳定性和重复性[18]。这一技术已经广泛用于包括Corynebacteriumpseudotuberculosis、Salmonella、Listeria、Lactobacilluscasei和Lactobacillusacidophilus等多种微生物菌种的分型[19-22]。本研究将同时利用1型CRISPR位点间区序列分析和ERIC-PCR指纹图谱技术对从三个家庭手工发酵酸奶中分离获得的30株嗜热链球菌进行分型，并对它们之间的分析结果和优缺点进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料和菌株 家庭手工制作的酸奶样品采集自陕西省；嗜热链球菌分离培养基采用M17固体培养基(英国Oxiod公司)。

1.1.2 材料与试剂rTaqDNA聚合酶和LATaqDNA聚合酶购自日本TaKaRa公司；Dpx高保真DNA聚合酶购自上海吐露港生物科技有限公司；三菱AnaeroPackSystem-Anaero厌氧产气袋购自日本Mitsubishi Gas化学公司；细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；其他生化试剂购自上海生物工程公司。

1.1.3 主要仪器 Mastercycler®pro s梯度PCR仪(德国eppendorf公司)，Tanon-EPS 300电泳仪(上海天能科技有限公司)，Bio-rad凝胶成像分析系统(美国伯乐公司)。

1.2 方法

1.2.1 嗜热链球菌的分离 按常规方法分离酸奶样品中的嗜热链球菌，具体步骤如下：将酸奶样品利用灭菌的生理盐水进行梯度稀释并涂于M17平板培养基上，置于厌氧罐中43 ℃培养48 h。挑取单克隆于盛有M17液体培养基的96孔板中，置于厌氧罐中43 ℃培养48 h。

1.2.2 分离菌株基因组DNA的提取 使用天根细菌基因组提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA，具体操作按说明书进行。

1.2.3 分离菌株的鉴定与分型 ①分离菌株的16S rRNA基因鉴定：以分离菌的基因组DNA为模板，引物采用27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，并利用rTaqDNA聚合酶扩增分离菌株的16S rRNA基因，并用引物27F进行测序，通过序列比对确定分离菌株种属。②分离菌株的ERIC-PCR 指纹图谱分析：以分离菌株的基因组DNA为模板，利用LATaqDNA聚合酶进行扩增。反应体系如下： 25 μL反应体系中包含2.5 μL 10×LA buffer(Mg2+free)，2 μL 25 mmol/L MgCl2溶液，2 μL 2.5 mmol/L dNTP, 20 μmol/L E1(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′)和E2(5′-AAGTAAGTgACTGGGGTGAGCG-3′)引物各0.5 μL ，模板DNA 40～80 ng，2.5 ULATaqDNA聚合酶，用双蒸馏水补足反应体系。PCR扩增程序：95 ℃预变性7 min(预变性之后加入LATaqDNA聚合酶)； 94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min, 65 ℃ 8 min，共30 个循环;最后 65 ℃退火 16 min。用Quantity One软件分析ERIC-PCR指纹图谱，结果导入到Past软件中，使用Dice相似性系数进行指纹图谱之间相似性的计算，在此基础上使用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)算法构建聚类矩形图。③分离菌株的1型CRISPR位点PCR扩增： 以分离菌的基因组DNA为模板，利用Dpx高保真DNA聚合酶进行扩增。 50 μL反应体系中包括5 μL 10×Dpx Buffer，5 μL 2 mmol/L dNTP，嗜热链球菌1型CRISPR位点特异性引物YC70(5′-TGCTGAGACAACCTAGTCTCTC-3′)和CR1-rev (5′-TAAACAGAGCCTCCCTATCC-3′)各0.5 μL，5 U Dpx DNA聚合酶，模板DNA 30～50 ng，用双蒸水补足体系到50 μL。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的长度，然后用引物YC70和CR1-rev对PCR产物进行测序，并最终测通。④分离菌株的1型CRISPR位点间区序列分析： 将分离菌株的CRISPR测序结果提交CRISPR Finder(http://crispr.u-psud.fr/Server/)鉴定其中的间区序列。序列不同的间区分别用不同的方格图案染色表示，并按照在CRISPR位点中的顺序进行排列。

2 结果与分析

2.1 嗜热链球菌的分离

使用M17培养基从样品SX1、SX2和SX3中分别分离了8株、8株和14株菌，通过16S rRNA基因序列测定，与标准菌株S.thermophilesATCC 19258的相似性在99.5%～100%之间，表明它们都属于嗜热链球菌。

图1 分离菌株的ERIC-PCR指纹图谱(每种亚型至少选择一个菌株，见图2)Fig.1 ERIC-PCR fingerprints of S. thermophiles isolates (At least one strain was selected from each subtype in Fig.2)M：DNA分子标记M：DNA marker

2.2 嗜热链球菌的ERIC-PCR指纹图谱分析

ERIC-PCR指纹图谱分析是常规的菌株分型方法，首先用这一常规方法对分离获得的30株嗜热链球菌进行了菌株分型，如图1所示，这些菌株的指纹图谱在1.3 kb处共有一条主带，这条共有的优势条带可能是嗜热链球菌所特异性拥有的。在样品SX1中，可以明显观察到8号菌株与其他3株菌的差异，即在1.5 kb以上比其他菌株多了3条微弱却单一的条带；在样品SX2中1、3号和2、5号菌株的差异则在2 kb左右的条带上；样品SX3中，10号菌株与其他3株相比缺少了在900 bp左右处的条带。对这些指纹图谱进行聚类分析，结果表明从3个样品中分离到的嗜热链球菌分别聚为3个cluster，表明这些乳酸菌可以根据分离的样品分为3种类型。同一类型中的乳酸菌具有比较高的相似度，指纹图谱的相似性都在80%以上(图2)。同一类型的样品内部又可以分为2种亚型，共6种亚型，即Type1-1、Type1-2、Type2-1、Type2-2、Type3-1和Type3-2，每个亚型的指纹图谱是完全相同的。

图2 30株嗜热链球菌ERIC-PCR指纹图谱的聚类分析结果Fig.2 Clustering analysis of ERIC-PCR fingerprintings for 30 S. thermophiles isolates

2.3 嗜热链球菌1型CRISPR位点的扩增及间区序列分析

首先利用嗜热链球菌特异性引物对分离获得的30株菌的1型CRISPR位点进行了PCR扩增。如图3所示，这30株嗜热链球菌均可扩增出单一的条带，且条带大小都在2 kb到3 kb之间，通过琼脂糖凝胶电泳很难分辨出它们大小的差异。所以，根据ERIC-PCR 聚类结果选出16个代表菌株(包含了所有的亚型)并对其1型CRISPR位点的PCR产物进行了测序。

随后通过CRISPR Finder对16株嗜热链球菌的CRISPR位点进行序列分析，找出每个菌株CRISPR位点内的间区序列。其中，为了更加直观地比较CRISPR片段中间区序列的差异，不同的间区序列采用不同的图案来表示(图4)。从图4可以看出，从样品SX2中分离的4株菌的1型CRISPR位点均含有27个间区序列且间区序列的组成和排列完全相同；从样品SX1中分离的6株菌的1型CRISPR位点均含有20个间区序列且间区序列的组成和排列完全相同；从样品SX3中分离的6株菌的1型CRISPR位点均含有27到28个间区序列，菌株SX3-5和SX3-8的CRISPR位点比其他4个菌株缺少一个间区，除此之外6个菌株CRISPR位点间区序列的组成和排列完全相同。因此根据CRISPR位点间区序列的比对情况，所有不同分离来源的菌株可以明显分为3种类型(图4)：不同类型菌株间没有相同的间区序列；而同一类型菌株间，间区序列的组成和排列则基本一致。通过对同一菌株的CRISPR位点进行分析，发现有些间区序列重复出现了几次，例如从样品SX2分离的4株菌中，每个菌株均含有5对重复的间区序列，分别为S12和S20、S13和S21、S14和S22、S15和S23、S16和S24；而从样品SX1分离的6株菌中，每个菌株均含有1对重复的间区序列，即S14和S17，类似的现象也曾出现在S.thermophilesDGCC 6297的1型CRISPR位点中[17]。出现这种现象的原因可能是菌株被相似的噬菌体侵染过，或者是CRISPR序列自我复制形成的。

图3 30株嗜热链球菌CRISPR位点PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products obtained from CRISPR1 locus for 30 S. thermophiles isolates

图4 16株代表菌株的CRISPR中间区序列的排布示意图Fig.4 Arrangement of spacers across the CRISPR locus for S. thermophiles strains序列不同的间区序列用不同图案的方块表示Each spacer is represented by a combination of one select character in a particular font color, on a particular background color

2.4 两种分型方法的结果比较

用1型CRISPR位点间区序列分析对30株嗜热链球的分型结果与常规的ERIC-PCR指纹图谱技术获得的结果基本一致，说明1型CRISPR位点间区序列分析是嗜热链球菌分型鉴定的可靠方法。但是研究发现两种分析方法获得的结果之间也存在一些差异，ERIC-PCR指纹图谱分析似乎对于菌株间基因组的变异更为敏感，可以把同一类型的菌株分为更多的亚型。

3 讨 论

由于CRISPR位点的间区序列来源于侵染宿主的噬菌体，所以CRISPR位点间区序列反映了噬菌体与宿主之间的相互识别，同时CRISPR位点间区序列的排列也反映了菌株对环境适应性进化的结果，这可能是CRISPR位点间区序列能够应用菌株分析的原因。

由于不适用于大量的菌株信息的存储和比较，所以包括ERIC-PCR在内的、基于指纹图谱的方法在对大量菌株进行分型时存在明显的劣势。而基于CRISPR位点间区序列分析的分型方法正可以弥补这一缺陷，可以将不同菌株的间区序列及其排序存储在数据库中并进行相互比较。而与需要对多个位点进行测序的MLST技术相比较，CRISPR位点间区序列分析的分型方法只需要测定一个CRISPR位点(一般小于4 kb)，所以分型速度更快、成本更低。根据本研究的结果，甚至只需要测定CRISPR位点两头的序列就可以达到相同的分型效果。因此基于CRISPR位点间区的序列分析可能会在包括嗜热链球菌等普遍含有CRISPR位点的微生物菌株分型中有广泛应用前景。

[1] 白娜, 于洁, 王宏梅, 等. 发酵乳后熟期间嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌产乙醛特性[J]. 乳业科学与技术, 2014, 37(1): 1-5.

[2] Beal C, Skokanova J, Latrille E, et al. Combined effects of culture conditions and storage time on acidification and viscosity of stirred yogurt[J]. Journal of Dairy Science, 1999, 82(4): 673-681.

[3] 郜洪涛, 吕嘉枥，闫肃, 等.嗜热链球菌对酸奶发酵的影响及应用前景[J]. 中国酿造, 2010, 29(11): 5-8.

[4] Lazzi, Bove C G, Sgarbi E, et al. Application of AFLP fingerprint analysis for studying the biodiversity ofStreptococcusthermophilus[J]. Journal of microbiological methods, 2009, 79(1): 48-54.

[5] Moschetti G, Blaiotta G, Aponte M, et al. Random amplified polymorphic DNA and amplified ribosomal DNA spacer polymorphism: powerful methods to differentiateStreptococcusthermophilusstrains[J]. Journal of Applied Microbiology, 1998, 85(1): 25-36.

[6] O’Sullivan T F, Fitzgerald G F. Comparison ofStreptococcusthermophilusstrains by pulse field gel electrophoresis of genomic DNA[J]. FEMS microbiology letters, 1998, 168(2): 213-219.

[7] Grissa I, Bouchon P, Pourcel C,et al. On-line resources for bacterial micro-evolution studies using MLVA or CRISPR typing[J]. Biochimie, 2008, 90(4): 660-668.

[8] Yu J, Sun Z, Liu W, et al. Multilocus sequence typing ofStreptococcusthermophilusfrom naturally fermented dairy foods in China and Mongolia[J]. BMC microbiology, 2015, 15(1): 236.

[9] Lindstedt B A. Multiple-locus variable number tandem repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria[J]. Electrophoresis, 2005, 26(13): 2567-2582.

[10]Jansen R, Embden J, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology, 2002, 43(6): 1565-1575.

[11]Sorek R, Kunin V, Hugenholtz P. CRISPR-a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6(3): 181-186.

[12]Jansen R, Embden J, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular microbiology, 2002, 43(6): 1565-1575.

[13]Kunin V, Sorek R, Hugenholtz P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats[J]. Genome Biol, 2007, 8(4): R61.

[14]Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science, 2007, 315(5819): 1709-1712.

[15]崔玉军, 李艳君，颜焱锋, 等.规律成簇的间隔短回文重复: 结构, 功能与应用[J]. 微生物学报, 2008, 48(11): 1549-1555.

[16]Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin[J]. Microbiology-Sgm, 2005, 151: 2551-2561.

[18]Gillings M, Holley M. Amplification of anonymous DNA fragments using pairs of long primers generates reproducible DNA fingerprints that are sensitive to genetic variation[J]. Electrophoresis, 1997, 18(9): 1512-1518.

[19]Dorneles E M S, Santana J A, Andrade G I, et al. Molecular characterization ofCorynebacteriumpseudotuberculosisisolated from goats using ERIC-PCR[J]. Genetics and Molecular Research, 2012, 11(3): 2051-2059.

[20]游勇来.沙门氏菌的分离鉴定及 PCR 快速分型的研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2013.

[21]Laciar A, Vaca L, Lopresti R, et al. DNA fingerprinting by ERIC-PCR for comparingListeriaspp. strains isolated from different sources in San Luis, Argentina[J]. Revista Argentina de microbiologia, 2006, 38(2): 55.

[22]孙志宏. 自然发酵酸马奶中乳杆菌的 DNA 多态性研究[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2006.

Application of Spacers of CRISPR 1 Locus to TypingStreptococcusthermophilesStrains

ZHANG Lu-lu1, 3, YAN Xing2, ZHAO Yong1, 3

(1.Coll.ofFoodSci. &Technol.,ShanghaiOceanUni.,Shanghai201306; 2.KeyLab.ofSynth.Biol.,ShanghaiInst.ofPlantPhysiol. &Ecol.,ChineseAcad.ofSci.,Shanghai201306; 3.Lab.ofQual. &SafetyRiskAssessm’tforAquaticProd.onStorage&Preserv’n(Shanghai),MinistryofAgric.Shanghai201306)

In order to establish a strain typing method suitable for investigating the diversity ofStreptococcusthermophilesresources based on spacers of CRISPR 1 locus attempted to analyze the strain typing ofS.thermophilesand compared with the routine ERIC-PCR finger print spectrum method. The results showed that the spacers CRISPR 1 locus sequence analyses could divide 30 strains isolated from three different samples into three types with obvious differences: there were no similar spacer among different type of strains; and the component and arrangement among the same type of strain were basically consistent, and furthermore the results of the above mentioned typing totally accorded with the results obtained by ERIC-PCR finger print spectrum technology. Therefore, analyses on spacers of CRISPR1 locus was a reliable method for typing characterization of strains ofS.thermophilesand was especially suitable for typing classification and diversity investigation at large amount of strains.

Streptococcusthermophiles; CRISPR1 locus; spacer sequence analysis; ERIC-PCR finger print spectrum; strain typing

中国科学院科技服务网络计划(STS计划)项目(KFJ-EW-STS-029)

张璐璐 女，硕士研究生。研究方向为食品微生物学。E-mail:llzhang0907@163.com

* 通讯作者。严兴 男，副研究员，博士。研究方向为工业微生物收集与保藏。Tel:021-54924049, E-mail:yanxing@sibs.ac.cn

2016-01-06；

2016-03-14

Q93-31;TS252.42

A

1005-7021(2016)06-0029-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.005

赵勇 男，教授，博士。研究方向为食品安全风险评估。Tel:021-61900503, E-mail: yzhao@shou.edu.cn