赵昍朋(综述)，张　媛，肖　瑞(审校)

(内蒙古医科大学基础医学院生理学教研室，内蒙古自治区分子病理学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010059)



·综述·

泛素-蛋白酶体通路在男性生殖领域的研究进展

赵昍朋(综述)，张媛，肖瑞*(审校)

(内蒙古医科大学基础医学院生理学教研室，内蒙古自治区分子病理学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010059)

[关键词]生殖；泛素；精子发生；综述文献

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.032

泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin proteasome pathway，UPP)介导的蛋白降解是机体内一个主要的调节细胞内蛋白水平的过程。泛素化是指泛素在一些特殊的酶(泛素激活酶、泛素结合酶、泛素连接酶等)作用下，将细胞内的蛋白进行靶向分类及特异性修饰的过程[1]。而蛋白酶体系统可以识别已泛素化的蛋白并加以降解。因此，UPP在调节体内蛋白的定位和功能等方面都起着十分重要的作用。男性精子的生成是一个复杂而有序的过程，据调查UPP在生精细胞内蛋白和细胞器的降解中发挥着重要作用[2]。现将UPP在男性生殖系统研究领域的相关进展以及UPP异常对男性不育的影响综述如下。

1　UPP介绍

UPP由泛素、泛素启动酶系统和蛋白酶体系统组成[3]。

1.1泛素泛素是细胞核和细胞浆中的高度保守的小分子蛋白，它广泛存在于真核生物的细胞表面[4]，是由76种氨基酸组成的低分子量热稳定蛋白，相对分子质量大约为8 500 000。在泛素酶的催化下，泛素的C-末端甘氨酸与靶蛋白的赖氨酸侧链相连, 而后其他泛素分子以甘氨酸残基连接到先前结合的泛素分子的赖氨酸侧链上而形成多泛素化链[5]。泛素也可以标记跨膜蛋白，参与蛋白质的膜泡运输。非典型泛素链在细胞信号传导、内吞，以及DNA损伤修复、调控哺乳动物的转录因子通路中起着重要作用。

1.2泛素启动酶系统蛋白质的泛素化是一个或多个泛素分子的底物蛋白的共价连接，这一系列活动共包括3种泛素启动酶，即泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme，E2)、泛素连接酶(ubiquitin protein ligase，E3)[6]。E1将泛素分子激活后，泛素途径得以启动，泛素再通过硫酯键转移到E2，而E3又与E2相互作用，将泛素转移到靶蛋白的残基上[7]。具体为一个泛素分子在基底膜上连结赖氨酸残基，剩下的泛素分子则通过赖氨酸残基形成串联而完成一次单泛素化，这一过程共连结了7个赖氨酸残基(Lys 6、Lys 11、 Lys 27、 Lys 29、Lys 33、Lys 48和 Lys 63)，从而形成泛素链[8]。然而，一种泛素链也可以有不同的结果，如Lys 11-泛素链可以通过内质网或蛋白酶体促进靶蛋白的降解[9]。这一过程不断反复，靶蛋白即被绑上一批泛素分子，被泛素标记的靶蛋白再在蛋白酶体中进行降解。

1.3蛋白酶体系统从结构上看，蛋白酶体是一个桶状的复合物[10]，其普遍存在于真核生物细胞的细胞核及细胞质中，是细胞用来调控蛋白质浓度和去除错误折叠蛋白的主要机制。较为常见的为26 S蛋白酶体，包含一个19 S的调节亚基和一个20 S的调节亚基。前者的亚基可以识别展开的泛素链，而后者能够降解肽链或未折叠底物[11]。

1.4去泛素化酶去泛素化是反向的泛素化过程,这一过程依赖于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)，DUBs可以拆解泛素链与蛋白底物，具体作用如下：①处理泛素前体；②回收泛素化过程中的泛素；③编辑泛素链；④泛素结合的逆转[7]。因此,去泛素化过程在蛋白酶体调控过程中起到了关键性的作用。虽然目前去泛素化的生理作用尚不清楚，但DUBs在参与细胞的生理功能方面，如细胞的凋亡和细胞的周期、蛋白降解、基因表达、染色体分离和脱氧核糖核酸的修复方面起到了十分重要的作用[12-13]。

近年来随着对UPP研究的深入，逐步发现UPP在变构蛋白的降解、原癌基因产物的降解[14]、转录因子的降解及细胞胞质分裂中均起着重要的作用。

2　UPP与精子发生

精子的产生是一个复杂而有序的过程。从精原细胞的分化到精子的成熟，其间包括有丝分裂、减数分裂以及精子形成都在生精小管中进行[15]。UPP参与精子发生的不同阶段，即精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂及精子形成。表明UPP在整个精子的形成过程中发挥着重要作用[16]。

2.1线粒体泛素化与精子发生在精子形成过程中，泛素化是必不可少的途径，尤其是哺乳动物线粒体的泛素化，决定着男性精子的命运。精子中约有200～3 000个线粒体，而精子的正常功能的运转离不开线粒体，线粒体几乎供应着生物体细胞中所有的能量。尽管具体机制尚不清楚，但泛素化过程的异常导致线粒体的退化从而最终影响精子的健康是毋庸置疑的。

在精子的发生过程中，线粒体供应绝大多数细胞生理过程中所需的能量，如减数分裂、精子细胞分化、精子存活以及精子获能。在精子形成过程中，线粒体逐渐变小、变长并在尾部聚集，盘旋环绕中间轴而形成线粒体鞘，为尾部旋转提供能量。在线粒体的形成变化过程，UPP的缺陷会影响线粒体功能，如泛素结合酶ubc4和ubc5的消耗将最终影响线粒体的供能[17]，而在精子的发生过程中E3的缺乏将影响线粒体的供能[18]。因此，线粒体的泛素化对哺乳动物来说是精子形成过程中的一个必不可少的步骤。在生殖细胞中线粒体和泛素酶通过一些特殊的线粒体蛋白相关联，即UPP参与精子发生中线粒体的降解。在有关小鼠受精卵的研究中发现，精子在与卵细胞结合时，精子中已被泛素化的线粒体被卵细胞的UPP所降解[19]。表明精子中的线粒体被泛素标记后同种之间才能进行受精。而相反，在野牛杂交研究中发现，在异种之间的精子中被泛素标记的线粒体则不能识别卵细胞中的蛋白酶体，即不能受孕。以上研究均表明线粒体泛素化在生精以及受精过程中有着重要作用。

然而在精子发生过程中线粒体泛素化的具体机制仍不清楚，如损失泛素化的底物是否会造成精子发生过程中线粒体的退化，从而导致不健康的精子，以上等问题都亟待解决。

2.2UPP酶与精子发生UPP离不开E1、E2、E3和蛋白酶体[20]。其中最为常见的是E3[21]，但每一个成分都是UPP过程所不可缺少的。

在小鼠的研究中发现，E1在睾丸中有特异性表达。其在精原细胞中的表达水平要明显高于在精母细胞和支持细胞中的表达水平。这表明E1可能影响了小鼠的精子发生。E2是一个庞大的家族，据研究发现，大量的E2都参与了精子的发生过程[22]。如ubc4-1 mRNA几乎在所有的生精阶段中表达，而ubc4-2 mRNA主要表现在圆形和长形精子细胞，ubc9可以在精子发生过程中的减数分裂中起调节作用[23]。E3中的一个代表RNF，在睾丸中特异性表达，其中RNF19A参与了精子尾部的形成，并且与Psmc(26 S蛋白酶体的一部分)共同参与了精子头部形成过程中的泛素化。也有报道表明RNF151在睾丸中高度表达并且有调控精子发生的作用。以上均说明E3在某些特定的底物泛素化过程中对雄性生殖细胞发育的重要性[24]。

目前，有关蛋白酶体方面的研究范围已十分广泛，通常，蛋白酶体活力的下降也将导致精子发生的缺陷。一些蛋白酶体激活剂的缺乏也会导致产生畸形的精子。而精子细胞中的一些特殊蛋白结构也参与泛素化，从而有助于促进精子的成熟。

2.3泛素与精子发生精子的发生是一个复杂而有序的细胞分裂与分化的过程，二倍体精原细胞发展成为一个单倍体雄性配体进而成为精子， 在人类中整个过程需耗费74 d[25]。泛素是男性精液的重要组分，有调查显示在男性不育患者体内泛素的含量明显增加，而伴随着精液中泛素含量的增加，精子的形态、数量和活动能力均有所下降。表明泛素可以作为衡量精子质量的一项指标。

2.4附睾中精子的泛素化精子发生的过程十分繁复，过程中难免会产生异常的精子。这些异常的精子伴随正常的精子将一起在附睾中进行处理。而这些畸形的精子如何被淘汰这一过程也是十分重要的。人们在小鼠的附睾腔中进行泛素化免疫反应检测发现，一些蛋白的泛素化发生在附睾。畸形的精子会被泛素化然后在附睾中被蛋白酶体所降解、消除。这表明UPP是精子在附睾中成熟及高质量的保证。可是，至今仍有许多问题仍不明朗，如究竟是什么E3结合在附睾中的精子表面。

3　UPP与睾丸癌

睾丸癌占男性肿瘤的1%～1.5%，其组织学类型多为精原细胞瘤。众所周知，癌症的恶化与细胞周期的异常及肿瘤细胞的转移密切相关。在精子发生过程中，如同前面所介绍的，包括有丝分裂和减数分裂均离不开UPP，如果有丝分裂和减数分裂发生异常，将使细胞周期发生改变，从而导致细胞过度分化，最终产生睾丸癌。

在精子发生过程中，细胞凋亡对高质量的精子的产生有着重要的影响，而p53是细胞凋亡中的一个重要的调节因子。p53是人体的一个抑癌基因，是一种相对分子质量为53 000的蛋白质，p53的失活对睾丸癌的形成有着重要影响。MDM2是E3连接酶的一种，与p53泛素化并最终通过蛋白酶体降解它。而E3的失衡将会导致p53的过度降解，从而影响细胞凋亡，最后导致癌症。因此，UPP在今后用于诊断及治疗睾丸癌方面都将会成为学者所关注的热点。

4　结　　语

全世界的已婚不孕不育夫妇中，50%与男性因素有关。男性不育是一个复杂的且受多因素影响的过程。近年来随着细胞生物学和遗传生物学领域研究的不断深入，在男性不育方面也取得了新的进展，但仍有很多机制尚不明确。E3将泛素结合到靶蛋白的细胞表面或细胞器上，再由蛋白酶体进行降解并间接地处理多余的细胞质。在这一过程中，如果UPP的某个成分产生了异常，则不能产生功能性的精子。这些异常的精子再在附睾中成熟，则会使精子的质量降低从而导致不育。相反，如果掌握了UPP在精子发生中的机制，则可以避免这一问题，从而控制精子产生的质量。此外，肿瘤的发生也受着泛素化的影响，蛋白酶体的应用将为肿瘤的治疗提供突破性的进展，这也为研究睾丸癌提供了方向。对泛素在这些途径中作用的研究, 将有助于对机体相关的生理机制和疾病的认识, 也将有助于新的治疗方法和新的靶向药物的发现。

总之，UPP与精子在睾丸内的分化成熟以及其他生殖领域，包括卵子发生、受精、胚胎发育等方面发挥着重要作用。此外，泛素在附睾精子的线粒体的质量控制与调节方面也很重要，UPP的研究也应用于不孕不育、避孕、动物基因改良、克隆研究等领域。而随着研究的进展，相信UPP将为人类的生殖健康和疾病研究等带来福音。

[参考文献]

[1]Chowdhury M,Enenkel C. Intracellular dynamics of the ubiquitin-proteasome-system[J]. F1000Res,2015,4:367.

[2]Bose R,Manku G,Culty M,et al. Ubiquitin-proteasome system in spermatogenesis[J]. Adv Exp Med Biol,2014,759:181-213.

[3]Buckley DL,Crews CM. Small-molecule control of intracellular protein levels through modulation of the ubiquitin proteasome system[J]. Angew Chem Int Ed Engl,2014,53(9):2312-2330.

[4]Song WH,Ballard JW,Yi YJ,et al. Regulation of mitochondrial genome inheritance by autophagy and ubiquitin-proteasome system: implications for health, fitness, and fertility[J]. Biomed Res Int,2014,2014:981867.

[5]Scott D,Oldham NJ,Strachan J,et al. Ubiquitin-binding domains: mechanisms of ubiquitin recognition and use as tools to investigate ubiquitin-modified proteomes[J]. Proteomics,2015,15(5/6):844-861.

[6]Walczak H,Iwai K,Dikic I. Generation and physiological roles of linear ubiquitin chains[J]. BMC Biol,2012,10:23.

[7]Hanpude P,Bhattacharya S,Dey AK,et al. Deubiquitinating enzymes in cellular signaling and disease regulation[J]. IUBMB Life,2015,67(7):544-555.

[8]Hospenthal MK, Mevissen TE, Komander D. Deubiquitinase-based analysis of ubiquitin chain architecture using Ubiquitin Chain Restriction (UbiCRest)[J].Nat Protoc,2015,10(2):349-361.

[9]Kulathu Y, Komander D.Atypical ubiquitylation-the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2012,13(8):508-523.

[10]Kish-Trier E,Hill CP. Structural biology of the proteasome[J]. Annu Rev Biophys,2013,42:29-49.

[11]Sako K,Yanagawa Y,Kanai T,et al. Proteomic analysis of the 26S proteasome reveals its direct interaction with transit peptides of plastid protein precursors for their degradation[J]. J Proteome Res,2014,13(7):3223-3230.

[12]Ramakrishna S,Kim KS,Baek KH. Posttranslational modifications of defined embryonic reprogramming transcription factors[J].Cell Reprogramm,2014,16(2):108-120.

[13]Ramakrishna S,Suresh B,Baek KH. Biological functions of hyaluronan and cytokine-inducible deubiquitinating enzymes[J]. Biochim Biophys Acta,2015,1855(1):83-91.

[14]Thirunavukarasou A,Singh P,Govindarajalu G,et al. E3 ubiquitin ligase Cullin4B mediated polyubiquitination of p53 for its degradation[J]. Mol Cell Biochem,2014,390(1/2):93-100.

[15]Xiao X,Mruk DD,Wong CK,et al. Germ cell transport across the seminiferous epithelium during spermatogenesis[J]. Physiology(Bethesda),2014,29(4):286-298.

[16]Hou CC,Yang WX. New insights to the ubiquitin-proteasome pathway(UPP) mechanism during spermatogenesis[J]. Mol Biol Rep,2013,40(4):3213-3230.

[17]Manku G,Wing SS,Culty M. Expression of the ubiquitin proteasome system in neonatal rat gonocytes and spermatogonia: role in gonocyte differentiation[J]. Biol Reprod,2012,87(2):44.

[18]Nagashima S,Tokuyama T,Yonashiro R,et al. Roles of mitochondrial ubiquitin ligase MITOL/MARCH5 in mitochondrial dynamics and diseases[J]. J Biochem,2014,155(5):273-279.

[19]Li L,Gao G,Shankar J,et al. p38 MAP kinase-dependent phosphorylation of the Gp78 E3 ubiquitin ligase controls ER-mitochondria association and mitochondria motility[J]. Mol Biol Cell,2015,26(21):3828-3840.

[20]Nakajima T,Kitagawa K,Ohhata T,et al. Regulation of GATA-binding protein 2 levels via ubiquitin-dependent degradation by Fbw7:involvement of cyclin B-cyclin-dependent kinase 1-mediated phosphorylation of THR176 in GATA-binding protein 2[J]. J Biol Chem,2015,290(16):10368-10381.

[21]Vittal V,Stewart MD,Brzovic PS,et al. Regulating the Regulators:Recent Revelations in the Control of E3 Ubiquitin Ligases[J]. J Biol Chem,2015,290(35):21244-21251.

[22]Koenig PA,Nicholls PK,Schmidt FI,et al. The E2 ubiquitin-conjugating enzyme UBE2J1 is required for spermiogenesis in mice[J]. J Biol Chem,2014,289(50):34490-34502.

[23]Yuan YF,Zhai R,Liu XM,et al. SUMO-1 plays crucial roles for spindle organization,chromosome congression,and chromosome segregation during mouse oocyte meiotic maturation[J]. Mol Reprod Dev,2014,81(8):712-724.

[24]Bazalitska SV,Romanenko AM,Sakalo VS,et al. Immunohistochemical expression of ubiquitin protein in peritumoral tissue of patients with testicular germ cell tumors[J]. Lik Sprava,2015,(1/2):48-55.

[25]Shen CC,Kang YH,Cui DD,et al. Human testis-expressed sequence 101 is limitedly distributed in germinal epithelium of testis and disappears in seminoma[J]. Biol Res,2014,47:52.

(本文编辑：刘斯静)

[收稿日期]2016-01-22；[修回日期]2016-02-17

[基金项目]国家自然科学基金项目(31260260)；内蒙古自治区自然科学基金项目(2015MS0372)；内蒙古自治区“草原英才”项目

[作者简介]赵昍朋(1990-)，女，辽宁沈阳人，内蒙古医科大学医学硕士研究生，从事男性生殖研究。 *通讯作者。E-mail:xiaorui79@hotmail.com

[中图分类号]R698.2

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)07-0859-04