黄　波，　肖影群△，　罗达亚，　章　萍，　杨仙荷，　钟青梅，　王　武，　姚　迪

(1南昌大学附属感染病医院病理科，江西 南昌 330002；2南昌大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，江西 南昌 330006)



肝细胞癌中microRNA-375调控的基因网络分析*

黄波1，肖影群1△，罗达亚2，章萍1，杨仙荷1，钟青梅1，王武1，姚迪1

(1南昌大学附属感染病医院病理科，江西 南昌 330002；2南昌大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，江西 南昌 330006)

[摘要]目的： 探讨肝细胞癌中miR-375的表达及其调控的相关靶基因和信号通路。方法: 采用原位杂交检测miR-375在人肝癌组织芯片的表达情况；人全基因组表达谱芯片检测4株肝癌细胞株；MAS生物信息学软件筛选miR-375调控靶基因及相关信号通路。结果: 原位杂交结果显示miR-375在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)；人全基因组表达谱芯片结果分析显示4株转染miR-375的肝癌细胞的共上调基因有20个，共下调基因有17个；MAS生物信息学软件分析显示4株转染miR-375的肝癌细胞共有的上调信号通路有54条，下调信号通路有48条。结论: miR-375与肝细胞癌有密切的关系。对miR-375调控的肝细胞癌相关靶基因与信号通路进行多元化筛选，为后续全面深入的研究肝细胞癌发生发展的机制提供了便利。

[关键词]肝细胞癌； MicroRNA-375； 原位杂交； 基因芯片

MicroRNA(miRNAs)是近来发现的一组19～24个核苷酸组成的非编码RNA分子，它们与基因表达的调控相关。这些小分子调控的基因参与体内多种生理进程例如细胞增殖、生长、分化、凋亡及其他等。MicroRNA在转录后水平调控目的基因的表达，有证据显示miRNA在胚胎形成、细胞分化及包括肿瘤在内的许多疾病的发病机制中起重要作用[1]。近几年的研究结果显示miR-375的表达异常与多种肿瘤的发生发展相关。现有的关于miR-375与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的研究多数是着重于miR-375调控的某一个靶基因，如AEG-1、YAP、ATG7等，忽略了与之相关的信号通路及整个基因网络，使得miR-375的整体调控性不能被充分的认知。为此本课题利用肝癌组织芯片验证miR-375与HCC的关系，以高通量基因芯片结果为基础，结合生物信息学软件，初步筛选miR-375调控的靶基因、相关信号通路和基因网络，为后续机制研究奠定基础。

材料和方法

1材料

1.1细胞4株人肝癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7和SMMC-7721购于中国科学院细胞库；细胞培养于含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的高糖DMEM完全培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2组织芯片人肝癌组织芯片(HLiv-HCC150CS-01)购自上海芯超生物科技有限公司；肝细胞癌患者75例，取癌/癌旁各1点(癌旁组织是指距离癌组织5 cm以上的非癌组织)，共150例组织，芯片上的组织均经常规4%甲醛固定并石蜡包埋，5 μm厚度切片，直径1.5 mm。

2主要方法

2.1肝癌组织芯片的原位杂交检测按照Exiqon的原位杂交试剂盒miRCURY LNATMmicroRNA ISH Optimization Kit (FFPE)的操作说明进行实验。实验步骤:组织芯片脱蜡,蛋白酶K工作液(200 mg/L)37 ℃消化15 min, 0.1 mol/L的甘氨酸/PBS清洗1 min，DEPC-PBS漂洗5 min 2次,梯度乙醇脱水,置于预杂交液于55 ℃孵育30 min，同时将配好的探针杂交工作液90 ℃加热4 min，置于冰块10 min,置于探针杂交工作液于55 ℃杂交 1 h, 5×、1×、 0.2×的SSC于55 ℃洗涤各5 min后，切片置于1×washing buffer中室温洗涤5 min,切片置于1×blocking buffer中室温封闭15 min,切片置于1×blocking buffer稀释(1∶800)的Anti-DIG-AP室温反应1 h,切片置于1×washing buffer中，室温洗涤10 min 3次,切片置于1×detection buffer中，30 ℃平衡5 min、切片置于1×detection buffer 稀释(1∶50)的BCIP/NBT储备液30 ℃黑暗处显色0.5～1 h,KTBT缓冲液室温洗涤切片5 min 2次，水洗切片1 min 2次,核固红复染30 min后封片镜检。

2.2细胞转染肝癌细胞HepG2、HuH-7、Li-7和SMMC-7721每株分为control组和miR-375 mimic组,接种于8个60 mm培养板中，设S1为HepG2 control mimic,S2为HepG2 miR-375 mimic,S3为HuH-7 control mimic,S4为HuH-7 miR-375 mimic,S5为Li-7 control mimic,S6为Li-7 miR-375mimic,S7为SMMC-7721 control mimic,S8为SMMC-7721 miR-375 mimic。细胞转染按照Invitrogen公司的转染试剂盒Lipofectamine® 2000操作说明进行实验。

2.3转染前后肝癌细胞株总RNA的提取和实时荧光定量PCR检测总RNA提取实验操作按照TRIzol试剂盒说明书进行。取2 μg转染细胞株的总RNA，采用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)反转录为cDNA。按照RT SYBR Green Master Mix (SABiosciences)的操作说明，以U6为内参照，在Light Cycler 480 Ⅱ Instrument(Roche)上行PCR扩增，每个样品设置3个复孔。U6基因上游引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；所有引物均购自Integrated DNA Technologies。

2.4Roche人全基因组表达谱芯片分析提取的转染后细胞总RNA进行扩增和质量检测，NimbleGen One-Color DNA Labeling Kit对RNA进行标记，利用NimbleGen Hybridization System进行基因组芯片杂交分析，Axon GenePix 4000B scanner扫描杂交后芯片，NimbleScan 2.5 软件进行数据收集和标准化，Agilent GeneSpring GX 12.0 软件对收集的实验数据进行进一步的分析。

2.5芯片数据与信号通路分析应用Partek Genomic Suites(Partek)对 miRNA及mRNA表达芯片数据进行整理分析。应用TargetScan 6.2软件筛选miR-375的预测调控靶点，博奥生物有限公司的生物分子功能注释系统(Molecule Annotation System,MAS)对差异表达基因相关的信号通路及其调控基因进行分析。

3统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，计数资料率的比较采用2检验,计量资料组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1MiR-375的组织分析

miR-375主要定位于肝癌细胞胞浆，阳性信号呈蓝色或紫蓝色颗粒。根据阳性肿瘤细胞数量和阳性程度综合评判，由两位有经验的病理医生采用双盲法独立阅片并评分，具体标准参考文献施行[2]： 无阳性肿瘤细胞为0分、<10%阳性肿瘤细胞的为1分、有10%～50%阳性肿瘤细胞的为2分、>50%阳性肿瘤细胞的为3分；无显色者为0分、弱阳性，淡蓝色者为1分、中度阳性，蓝色者为2分、强阳性，深蓝色者为3分。以两个分数乘积≥6作为阳性表达的界限。由组织芯片可见miR-375在大部分肝癌组织中高表达，在绝大部分癌旁组织中低表达，见图1～3。

Figure 1.HE staining of tissue microarray (×40). A, B and C were the liver specimens from 3 patients

图1组织芯片的HE染色

Figure 2.Insituhybridization of miR-375 at tissue microarray (×40). A, B and C were the specimens from 3 HCC patients.

图2组织芯片的miR-375原位杂交结果(低倍镜)

Figure 3.Insituhybridization of miR-375 at tissue microarray (×400). A, B and C were the specimens from 3 HCC patients.

图3组织芯片的miR-375原位杂交结果(高倍镜)

肝癌组织芯片原位杂交结果显示，在75例肝癌组织中有41例表达阳性，34例表达阴性；在癌旁组织中，有2例表达阳性，73例表达阴性。miR-375在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01)，与病例年龄、性别、TNM分期及临床分期无显著相关性，见表1。

表1肝癌组织芯片miR-375表达与病例临床病理资料的关系

Table 1.The relationship between the expression of miR-375 and clinicopathologic data.

ParameternTheexpressionofmiR-375PositiveP2Specimens HCCtissue7541(54.67%)<0.0149.587 pericarcinoustissue752(2.67%)Age(year) ≤543918(65.71%)>0.052.376 ≥543623(54.05%)Sex Male6436(56.25%)>0.050.441 Female115(45.45%)Sizeoftumor(cm) ≤54930(61.22%)>0.050.108 ≥52611(42.31%)Clinicalstage(AJCC) 1-2stage4928(57.14%)>0.050.35 3-4stage2613(50.00%)

2miR-375的real-time PCR检测

以U6为阳性对照检测miR-375；肝癌细胞(HepG2、Huh-7、Li-7和SMMC-7721)转染后，miR-375的表达明显升高,见图4。

Figure 4.The expression of miR-375 was up-regulated in HCC cell lines after transfected wtih miR-375 mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol mimic.

图4miR-375 mimic转染后miR-375的表达

3miR-375的人全基因组表达谱芯片检测

结果显示，与mimic control转染组比较，miR-375 mimic转染的HepG2、Huh-7、Li-7和SMMC-7721细胞株中分别有2 305、424、892和1 050个基因表达上调(倍数值≥2.0)；分别有2 162、536、974和998个基因表达下调(倍数值≤-2.0)；4个转染细胞株中的共上调基因有20个，共下调基因有17个,见图5及表2～3。

Figure 5.Screening of co-expressed genes in HCC cell lines. S1: HepG2 control mimic; S2: HepG2 miR-375 mimic; S3: HuH-7 control mimic; S4: HuH-7 miR-375 mimic; S5: Li-7 control mimic; S6: Li-7 miR-375mimic; S7: SMMC-7721 control mimic; S8: SMMC-7721 miR-375 mimic. A: co-upregulated genes in the 4 HCC cell lines; B: co-downregulated genes in the 4 HCC cell lines.

图5肝癌细胞株共表达基因筛选

表2　4个肝癌细胞株的共上调基因

4差异表达基因的相关信号通路分析

将前述筛选到差异表达基因输入MAS生物信息学软件进行分析，4个细胞株共有的上调相关信号通路有54条，共有的下调相关信号通路下调有48条，见图6～7。

表3　4个肝癌细胞株的共下调基因

Figure 6.Part of signaling pathways related to up-regulated genes

图6上调基因相关的部分信号通路

讨论

HCC作为常见的恶性肿瘤之一，因缺乏有效的早期诊断方式及治疗手段其死亡率一直居高不下[2]，关于miR-375与HCC的研究也日愈增多。例如Huang等[4]用miR-25、miR-375和let-7f作为生物标志物，能很明显的从对照组中区分出HCC，单独应用miR-375预测HCC时，其特异性为96%，灵敏度为100%；Li等[5]在肝细胞癌标本中发现了6种表达明显上调的miRNAs，其中的miR-375和miR-92a具有HBV特异性；He等[6]的研究发现miR-375在HCC组织和细胞系中显著下调，miR-375在肝肿瘤细胞的高表达能抑制细胞的增殖、集落形成、迁移/侵袭并且诱导细胞周期G1停滞和细胞凋亡；Byoung等[7]发现miR-375可通过抑制AEG-1来减弱HCC细胞的迁移侵袭能力； Liu[8]等发现低表达的miR-375通过调控YAP促进HCC的发展；另外，根据Chang等[9]的研究，miR-375在肝癌细胞中的高表达可降低ATG7的表达从而减弱肝癌细胞在低氧条件下的生存能力，使得肝癌细胞的生长速度明显减慢且更易于发生坏死。由上述可知，现今对miR-375的研究尚无统一定论。

Figure 7.Part of signaling pathways related to down-regulated genes

图7下调基因相关的部分信号通路

为了进一步探究miR-375与HCC之间的内在联系，本实验进行了miR-375的real-time PCR和原位杂交检测，发现miR-375在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，与病例的年龄、性别、肿块大小及临床分期无相关性，这可能预示着miR-375仅仅在肝脏癌变过程中起着某种作用，而对肝癌细胞的生长、转移无影响。“miR-375在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织”这一实验结果与前述文献的一些研究结论有差异。针对这一现象，我们从多个方面进行研究验证。一是实验过程，我们是严格按照miR-375探针生产公司的操作流程进行，并进行了多次重复实验；二是实验条件，在进行了大量的预实验后，摸索出了最适实验条件，如蛋白酶K的浓度和消化时间、miR-375探针的浓度和显色时间等等；三是miR-375探针，我们分别利用了乳腺癌组织、乳腺癌细胞株、肝癌组织和肝癌细胞株进行了大量的实验验证，虽然在肝癌组织上其表达情况与部分文献有差异，但是在乳腺癌上与其它文献相一致，可以排除探针的问题。根据Li 等[5]的研究，在HBV阳性的血清中，包括miR-375在内的13种miRNAs表达上调，且miR-375具有HBV特异性，可用以区分出HBV组、HCV组和对照组；在HBV阳性的肝癌血清中，包括miR-375在内的6种miRNAs表达显著上调。因此，我们推测在肝组织中miR-375的表达或许也与HBV感染存在着某种联系，HBV阳性和阴性的肝癌组织中其miR-375的表达可能存在差异，造成这种差异的原因有待进一步的研究。

现有的大多数HCC与miR-375之间关系的研究都是从单一靶基因入手，这些研究并未把信号通路和相关基因网络纳入研究之中，这或许会使得研究结果有一定的局限性，不利于全面深入的了解HCC发生发展机制，因此本实验对4个细胞株的差异表达基因进行了初步筛选。其中的部分基因已有了相关研究，Bozkaya等[10]发现MUC1和c-Met在高侵袭性HCC细胞株和HCC组织中高表达，这二者的共表达与HCC的分化程度相关；袁时芳等[11]采用免疫组化方法检测43例原发性肝癌组织，肝细胞癌34例，胆管细胞癌9例和12例肝硬化及6例正常肝组织中MUC1的表达，发现肝癌组织中可见MUC1强阳性表达，肝硬化病变组织中仅2例可见MUC1弱阳性反应信号，正常肝组织中未见MUC1表达，MUC1在肝癌组织中的阳性表达率与其它两组肝组织之间差异有统计学意义，而MUC1在肝癌组织中阳性表达与肝癌组织的病理类型和组织学分化无明显关系。

通过上述差异表达基因结合MAS生物信息学软件，本实验筛选出了相关信号通路。这为认识HCC提供了初步方向，也为下一步的机制研究提供了便利。Chen等[12]的研究表明，MSI1在HCC中上调，在肝癌细胞株HepG2中高表达的MSI1能显著的促进细胞生长、肿瘤形成和细胞周期进程，敲除肝癌细胞株Huh7中的MSI1能极大的抑制细胞生长和肿瘤形成并使细胞周期静止在G1/S期，激活Wnt信号通路能使MSI1发挥原癌基因的作用从而调控细胞生长和细胞周期；贺松其等[13]发现肝细胞癌的转移侵袭与Wnt/β-catenin 信号通路密切相关，β-catenin 是Wnt/β-catenin信号传导途径中的关键调控因子，其表达程度与患者淋巴结转移及肝内转移呈正相关，Wnt/β-catenin 信号通路下游转录因子T细胞因子4基因表达与肝癌的转移密切相关，Wnt/β-catenin信号通路成员基因突变和(或)异常表达奠定了肝癌细胞转移和侵袭的分子学基础；赵军艳等[14]用免疫组化SP法检测肝癌组织芯片，观察MAPK途径和JAK-STAT途径中重要酪氨酸蛋白激酶ERK、p38、c-Jun、JAK、STAT3和STAT5的表达及其相互关系，发现MAPK和JAK-STAT信号通路的过度活化在肝癌发生发展过程中起重要作用；朱虹等[15]通过肝癌细胞实验结果推测ERK/MAPK信号通路是微环境诱导肝癌产生多药耐药的重要胞内信号传导途径。

综上所述，以高通量基因芯片分析结果为基础，结合生物信息学手段，对miR-375调控的肝细胞癌相关靶基因与信号通路进行多元化筛选，不仅能更全面地认识miR-375的作用机制，也为更准确的地选择新颖的miR-375调控靶基因提供了可能。在此基础上，可结合组织水平的免疫组化分析，以能够更快更精确地把握和验证miR-375的调控靶基因，为后续全面深入的研究HCC发生发展机制提供了便利，为研发HCC的早期诊断与治疗方法奠定理论基础，同时也为揭示miR-375调控HCC或者其他肿瘤发生发展的机制提供可靠的依据。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Analysis of gene network regulated by microRNA-375 in HCCHUANG Bo1, XIAO Ying-qun1, LUO Da-ya2, ZHANG Ping1, YANG Xian-he1, ZHONG Qing-mei1, WANG Wu1, YAO Di1

(1DepartmentofPathology,InfectiousDiseaseHospitalAffiliatedtoNanchangUniversity,Nanchang330002,China;2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofBasicMedicine,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:xiaoyq2008@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the expression of microRNA-375 (miR-375) in hepatocellular carcinoma (HCC) and to analyze the target genes and signaling pathways regulated by miR-375. METHODS: The expression of miR-375 was examined at tissue microarray of HCC byinsituhybridization. The whole human genome chip and bioinformatics analysis were applied to screen out the differential expression genes and signaling pathways in 4 HCC cell lines transfected with miR-375 mimic. RESULTS:Insituhybridization showed the expression of miR-375 in HCC tissues were obviously higher than that in tumor-adjacent tissues (P<0.05). There were 20 co-upregulated genes and 17 co-downregulated genes in all 4 cell lines. Bioinformatic analysis showed that there were 54 signaling pathways related to up-regulated genes and 48 signaling pathways related to down-regulated genes in all 4 cell lines. CONCLUSION: miR-375 may play a key role in the pathological process of HCC. The bioinformatic analysis is able to screen the target genes and signaling pathways regulated by miR-375 and to provide an explicit direction for further mechanism research on HCC.

[KEY WORDS]Hepatocellular carcinoma; MicroRNA-375;Insituhybridization; Gene chips

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.029

[中图分类号]R730.23； R735.7

[文献标志码]A

通讯作者△Tel： 0791-88499524； E-mail: xiaoyq2008@126.com

*[基金项目]2011江西省卫生厅科技计划(No. 20112043)； 2012年南昌市市校合作项目(洪财企[80]号)

[收稿日期]2015- 05- 14[修回日期] 2016- 01- 07

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0363- 08