曾令萍，　肖　瑛，　张莹莹，　张昌志，　吴德佩，　李圆圆，　石明隽，　郭　兵

(贵州医科大学病理生理学教研室，贵州 贵阳 550025)



BMP-7对高糖环境下肾小管上皮细胞Id2和E2A蛋白表达的影响*

曾令萍，肖瑛△，张莹莹，张昌志，吴德佩，李圆圆，石明隽，郭兵

(贵州医科大学病理生理学教研室，贵州 贵阳 550025)

[摘要]目的： 通过观察高糖环境下给予外源性骨形态发生蛋白-7(BMP-7)对肾小管上皮细胞(NRK-52E)表达分化抑制因子2(Id2)和转录因子E2A的影响，探讨BMP-7减轻高糖诱导的肾小管纤维化病变的可能机制。方法: 将体外培养的肾小管上皮细胞NRK-52E分为3组：对照(control)组、高糖(HG)组和不同浓度BMP-7(10 μg/L和20 μg/L)干预组，HG组和干预组分别设12 h、24 h和48 h 3个时点。Western blot方法检测Id2、E2A、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)蛋白的表达，real-time PCR方法检测Id2 mRNA的表达。结果: 与control组相比，HG组Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平明显下调，E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平明显上调(P<0.05)；与HG组相比，20 μg/L BMP-7干预组Id2的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白水平均较同时点显著上调，E2A、α-SMA和Col-Ⅰ的蛋白水平显著下调(P<0.05)。相关性分析结果显示，Id2蛋白与E2A蛋白表达呈显著负相关(P<0.05)。结论: BMP-7可阻断高糖诱导的肾小管上皮细胞的纤维化，其机制可能与促进Id2蛋白并抑制E2A蛋白的表达有关。

[关键词]NRK-52E细胞； 高糖； 骨形态发生蛋白-7； 分化抑制因子2； E2A

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见而严重的并发症，进行性发展可导致终末期肾衰竭，深入研究防治DN纤维化病变的发生机制，对疾病的转归具有重要意义。分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id)属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)转录因子家族，因缺乏碱性区域，可以与碱性螺旋-环-螺旋转录因子(basic helix-loop-helix，bHLH)E2A相结合形成异二聚体，从而发挥生物学效应。哺乳动物细胞含4种Id蛋白：Id1、 Id2、Id3和Id4。本课题组前期研究发现，DM大鼠随病程的延长肾组织中Id2蛋白逐渐减少，促进了肾小管上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及肾间质细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的沉积；控制血糖后Id2水平被上调，恢复了Id2对肾纤维化的负调节作用，从而使EMT过程逆转，ECM沉积减轻[1]。另有研究发现骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)具有抗纤维化作用，已有研究表明在肝纤维化、肾纤维化和肺纤维化疾病中BMP-7都能明显降低细胞的纤维化水平[2-4]。在小鼠晶状体上皮细胞中过表达BMP-7后可上调Id2、Id3的表达，从而逆转小鼠因损伤诱导的EMT[5]。这些都提示在EMT的发生发展中BMP-7、Id2和E2A之间有着密切的联系，而在高糖环境中三者的关系尚不清楚。本研究旨在观察外源性BMP-7对高糖环境中肾小管上皮细胞Id2和E2A表达的影响，探讨BMP-7减轻高糖状态下肾小管纤维化的作用机制。

材料和方法

1细胞

大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞株购于上海中科院细胞库。

2主要试剂

两步法免疫组化检测试剂、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥)；I抗稀释液、ECL 显色剂、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白(碧云天)；苯甲基磺酰氟(phenyl methyl sulfonyl fluoride，PMSF)和RIPA细胞裂解液(索莱宝)；PVDF膜、3 mm Whatman滤纸(Millipore)；低糖DMEM 培养基、胰酶蛋白、青霉素和链霉素(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)；iQTMSYBR®Green Supermix(Bio-Rad)；Id2、E2A抗体(Santa Cruz)；rhBMP-7(Sigma)；Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ，Col-Ⅰ)抗体(北京博奥森)；α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、β-actin抗体(武汉博士德)。

3主要方法

3.1细胞培养与分组把NRK-52E细胞复苏接种于25 cm2的培养瓶中，用含10% 胎牛血清的DMEM(含5.5 mmoL/L葡萄糖)培养。倒置显微镜下观察，待细胞融合度达80%～90%时进行传代。将状态良好的细胞同步化处理后随机分为3组：对照(control)组：用含有2% 胎牛血清的DMEM (含5.5 mmoL/L葡萄糖)培养，同步化后不予任何处理；高糖(high glucose,HG)组：用含有2% 胎牛血清的DMEM(含25 mmoL/L葡萄糖)培养；10 μg/L和20 μg/L BMP-7干预组：在含有2% 胎牛血清的DMEM(含25 mmoL/L葡萄糖)中加入不同浓度的BMP-7，使其终浓度分别为10 μg/L和20 μg/L。在高糖诱导和BMP-7干预后的12 h、24 h和48 h 3个时点收集RNA或蛋白进行后续实验。

3.2免疫细胞化学染色将NRK-52E细胞接种至铺有22 mm×22 mm盖玻片的6孔板中，生长融合度达80%时，细胞同步化处理，PBS漂洗，细胞固定液固定，3% H2O2浸泡消除内源性过氧化物酶，10% 牛血清白蛋白封闭，予细胞角蛋白18(cytokeratin,CK18； 1∶50)、E-cadherin(1∶100)和α-SMA(1∶300)特异性抗体4 ℃孵育过夜。PBS漂洗后滴加即用型生物素标记的 II 抗，DAB室温显色，苏木素复染，脱水，透明，晾干后，中性树胶封片，显微镜下观察并摄取图像。

3.3Western blot检测目的蛋白弃去细胞培养基后用生理盐水清洗3次，加入细胞蛋白裂解液裂解细胞，12 000 r/min离心10 min，将上清转移置一新的EP管中，取部分蛋白使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。然后根据蛋白浓度加入上样缓冲液配制成统一浓度的蛋白样品，煮沸10 min。蛋白经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜，分别加入Id2(1∶100)、E2A(1∶300)、E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶200)和Col-Ⅰ(1∶200)的 I抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入相应 II 抗室温孵育1 h，ECL显影，压片并分析结果。

3.4Real-time PCR检测Id2 mRNA的表达TRIzol法提取总RNA，核酸蛋白仪检测RNA浓度和纯度后，使用Thermo试剂盒进行逆转录。通过Bio-Rad CFX 96TM荧光定量PCR分析系统进行检测，以β-actin为内参照，目的基因的相对含量以2-△△Ct表示，引物序列和退火温度见表1。

表1PCR引物序列及扩增条件

Table 1.The sequences and conditions of primers used in real-time PCR

Name Sequences(5'-3')AnnealingtemperatureId2Forward:TACGAGCAGCATGAAAGCCT58℃Reverse:GAGCTTGGAGTAGCAGTCGTβ-actinForward:GCCAACACAGTGCTGTCT58℃Reverse:AGGAGCAATGATCTTGATCTT

4统计学处理

所有数据用SPSS 17.0统计软件分析处理，数据用均数±标准差(mean±SD)表示。多组比较采用单因素方差分析，若方差齐时，采用Bonferroni校正的t检验；若方差不齐时，则采用Games-Howell法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1NRK-52E细胞中CK-18、α-SMA和E-cadherin的表达

免疫细胞化学结果显示，在培养的NRK-52E细胞中肾小管上皮细胞标志蛋白CK-18、E-cadherin蛋白表达阳性，α-SMA表达阴性，说明培养的细胞为大鼠肾小管上皮细胞，见图1。

2BMP-7对高糖培养不同时点NRK-52E细胞中E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与control组相比，HG组E-cadherin蛋白表达明显减少(P<0.05)，以HG刺激24 h组减少最为显著；与HG组比较，10 μg/L BMP-7干预组E-cadherin蛋白仅24 h时增多(P<0.05)；而20 μg/L BMP-7干预组E-cadherin蛋白在12 h、 24 h和48 h表达均显著高于同期HG组(P<0.05)，24 h达最高峰。

Figure 1.Immunocytochemistry staining of CK-18, E-cadherin and α-SMA in NRK-52E cells (×400).

图1CK-18、E-cadherin和α-SMA在NRK-52E细胞中的表达

α-SMA在control组有少量表达，HG 12 h、24 h和48 h其表达均显著高于control组(P<0.05)；加入外源性10 μg/L的BMP-7干预后，HG 12 h和24 h组α-SMA的表达显著低于同期HG组(P<0.05)，而20 μg/L BMP-7干预组，各时点的α-SMA的表达均显著低于同期HG组(P<0.05)。

在control组Col-I有少量表达，HG 12 h、24 h和48 h其表达均显著高于control组(P<0.05)；加入外源性BMP-7(10 μg/L或20 μg/L)后，Col-Ⅰ的蛋白表达较同期HG组均下调(P<0.05)，见图2。

3BMP-7对高糖培养不同时点NRK-52E细胞中Id2 mRNA和蛋白表达的影响

Real-time PCR和Western blot结果显示，与control组相比，HG组Id2的mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05)；20 μg/L BMP-7干预组，各时点Id2的mRNA和蛋白的表达较同期HG组明显上调(P<0.05)；而在10 μg/L BMP-7干预组，Id2的mRNA和蛋白仅在24 h时点表达显著上调(P<0.05)，见图3。

4BMP-7对高糖培养不同时点NRK-52E细胞中E2A蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与control组相比，HG 12 h、24 h和48 h组E2A的表达均明显增多(P<0.05)；BMP-7干预组(10 μg/L和20 μg/L)组各时点E2A表达较同期HG组均明显下调(P<0.05)，见图4。

Figure 2.The effects of BMP-7 on the protein expression of E-cadherin, α-SMA and Col-I in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

图2BMP-7对高糖培养不同时点NRK-52E细胞中E-cadherin、α-SMA 和Col-Ⅰ蛋白表达的影响

Figure 3.The effects of BMP-7 on the mRNA and protein expression of Id2 in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group；*P﹤0.05vsHG group.

图3BMP-7对高糖培养不同时点NRK-52E细胞中mRNA和Id2蛋白表达的影响

Figure 4.The effects of BMP-7 on the protein expression of E2A in NRK-52E cells under different conditions. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsHG group.

图4BMP-7对高糖培养不同时点NRK-52E细胞中E2A蛋白表达的影响

5高糖条件下不同时点NRK-52E细胞中Id2蛋白与E2A蛋白表达量的相关性分析

相关性分析结果显示，Id2蛋白与E2A蛋白表达呈显著负相关，在12 h、24 h和48 h这3个时点的相关系数分别为-0.869、-0.957和-0.991(P<0.05)，见图5。

Figure 5.Correlation analysis between Id2 and E2A protein expression at different time points in NRK-52E cells under high glucose conditions.

图5高糖条件下不同时点NRK-52E细胞中Id2蛋白与E2A蛋白表达量的相关性分析

讨论

大量研究表明，肾小管上皮细胞发生EMT后伴随ECM的生成增多和降解减少，是肾小管间质纤维化包括DN发生发展的重要机制之一[6]。本研究显示，高糖培养NRK-52E细胞12 h、24 h和48 h后，肾小管上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达显著减少，间充质细胞标志性蛋白α-SMA的表达明显增多，并伴有Col-Ⅰ的高表达，这表明在高糖持续刺激下NRK-52E细胞发生了EMT，同时合成和分泌大量ECM。这与本课题前期研究结果一致[7]。

Id 蛋白是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的核转录因子的负调控蛋白，属于HLH 转录因子家族特别成员，哺乳动物含有4种Id因子(Id1～Id4)，119～199 个氨基酸残基。Id蛋白缺乏碱性DNA结合区，可以与bHLH形成异二聚体，抑制bHLH与DNA及其它组织特异性bHLH转录因子结合，抑制细胞分化并促进细胞的增殖[8]。目前有研究发现，Id2与一些脏器纤维化有关，并且有维持细胞正常生物学形态和抑制转分化的作用。过表达Id2可以维持肺泡上皮细胞表型，减轻肺纤维化[9]。在肝星状细胞中，通过逆转录病毒感染Id2可显著抑制α-SMA和Col-Ⅰ的mRNA表达，调节肝星状细胞的转分化[10]。目前国内外学者研究Id2在肿瘤、免疫系统及纤维化疾病中的作用机制时，都涉及到bHLH家族转录因子E2A基因[11-13]。E2A基因(又称TCF3，免疫球蛋白增强子结合因子E12/E47，ITF1)可以编码2种不同类型的蛋白产物，分别为E47和E12。已有研究证明E12和E47抑制E-cadherin表达并且可以调控α-SMA的表达[14-15]。免疫抑制剂环孢菌素A诱导人肾小管上皮细胞HK-2发生EMT过程中E2A表达逐渐增多；另外过表达E2A后α-SMA表达增多，E-cadherin表达减少，表明E2A在环孢菌素A诱导的EMT进展中有着重要作用[16]。Kondo等[11]研究发现TGF-β1诱导小鼠乳腺上皮细胞NMuMG的过程中能与E2A相互作用的Id蛋白表达下调，E2A产物增多并直接抑制E-cadherin表达，最终发生EMT。本研究显示，高糖刺激NRK-52E细胞后，Id2的蛋白和mRNA表达减少而E2A表达增多，且二者呈显著的负相关并伴随E-cadherin的表达显著减少，α-SMA的表达明显增多及Col-Ⅰ的增多，提示高糖环境中Id2和E2A蛋白参与了肾小管上皮细胞EMT的发生过程。

BMP-7作为一种成骨蛋白，属于TGF-β超家族中的一员，是维持肾脏正常发育的重要因子。本课题组前期研究发现，高糖刺激肾小管上皮细胞，BMP-7的蛋白和mRNA表达显著减少[17]。相反，Wang等[18]运用基因转染动物在DN病程中过表达BMP-7，可减轻尿蛋白的含量，改善肾功能，减少肾间质Col-Ⅰ及FN的沉积。Veerasamy等[19]也发现外源性的BMP-7可以通过Smad1/5信号通路上调Id2的表达来抑制TGF-β1刺激人近端肾小管上皮细胞后引起的α-SMA增多。然而，在高糖状态下，肾小管上皮细胞Id2和E2A表达变化是否受到BMP-7调节，目前还不清楚。因此，我们体外培养肾小管上皮细胞，在高糖环境中同时加入不同剂量的BMP-7(10 μg/L和20 μg/L)，并设12 h、24 h和48 h 3个时点，观察BMP-7对高糖状态下Id2和E2A表达的影响。结果显示，BMP-7可以显著逆转同时点高糖诱导的Id2的mRNA和蛋白下调及E2A蛋白的上调，使E-cadherin蛋白表达上调，而α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表达下调，提示Id2的mRNA和蛋白减少及E2A蛋白增多，可能是高糖状态下肾小管上皮细胞发生EMT，肾间质出现ECM沉积的原因之一，而BMP-7可能通过Smad1/5信号通路诱导Id2表达，抑制E2A活性，恢复E-cadherin的表达，减轻肾小管上皮细胞的EMT，减少肾间质ECM的沉积，减轻肾纤维化病变。但是Id2是直接还是通过某些机制调控E2A的还不清楚，需要进一步研究。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Effects of BMP-7 on Id2 and E2A expression in NRK-52E cells exposed to high glucoseZENG Ling-ping, XIAO Ying, ZHANG Ying-ying, ZHANG Chang-zhi, WU De-pei, LI Yuan-yuan, SHI Ming-jun, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China.E-mail：yxhx20060725@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) on the expression of transcription factor E2A and inhibitor of differentiation 2 (Id2) in the renal tubule epithelial cells(NRK-52E)exposed to high glucose, and to explore its possible mechanism of improving renal tubular fibrosis induced by high glucose. METHODS: The NRK-52E cells were divided into control group, high glucose (HG) group and high glucose with different doses of BMP-7 (10 μg/L and 20 μg/L) group. The cells in HG group and BMP-7 group were cultured for 12 h, 24 h and 48 h. The protein expression of Id2, E2A, E-cadherin, α-smooth muscle actin (α-SMA) and collagen-I was detected by Western blot. In addition, the mRNA expression of Id2 was detected by real-time PCR. RESULTS: Compared with control group, the mRNA and protein levels of Id2 and the protein level of E-cadherin were down-regulated, while the protein levels of E2A, α-SMA and collagen-I were up-regulated in HG group (P<0.05). Compared with HG group, the mRNA and protein levels of Id2 and the protein level of E-cadherin were significantly up-regulated, while the protein expression of E2A, α-SMA and collagen-I was significantly down-regulated in 20 μg/L BMP-7 group (P<0.05). The correlation analysis showed that the Id2 protein level was negatively correlated with the E2A protein level (P<0.05). CONCLUSION: BMP-7 may intercept the process of renal tubule fibrosis induced by high glucose via promoting the expression of Id2 and inhibiting the expression of E2A at protein level.

[KEY WORDS]NRK-52E cells; High glucose; Bone morphogenetic protein-7; Inhibitor of differentiation 2; E2A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.022

[中图分类号]R363; R 573.1

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 0851-8174011； E-mail: yxhx20060725@126.com

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81360116)；贵州省科学技术基金(黔科合J字[2011]2120号)；贵州省卫生厅科学技术基金项目(黔卫发[2013]71号)

[收稿日期]2015- 08- 28[修回日期] 2015- 12- 08

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0321- 06