钟长江，　岳喜磊#，　李建华，　许继德，　成　莹，　杨春涛

(广州医科大学生理学教研室，广东 广州 511436)



▲并列第1 作者

TRPC1在TGF-β1诱导支气管上皮细胞迁移中的作用*

钟长江▲，岳喜磊▲#，李建华，许继德△，成莹，杨春涛

(广州医科大学生理学教研室，广东 广州 511436)

[摘要]目的： 探究经典瞬时受体电位通道1(TRPC1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)迁移中的作用。方法: siRNA沉默TRPC1; CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡; 细胞划痕和Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭。Western blot检测E-钙黏蛋白和vimentin的蛋白表达。结果: TGF-β1刺激细胞后，TGF-β1组细胞的迁移距离大于对照组(P<0.01)。TGF-β1组和TRPC1沉默组的细胞活力和凋亡与对照组相比差异不显著；与TGF-β1组细胞比较，siRNA和 TGF-β1 共同作用组迁移能力明显降低(P<0.01)。与 TGF-β1 组相比，siRNA沉默TRPC1和 TGF-β1 共同作用组E-钙黏蛋白的蛋白表达明显降低(P<0.05)，而vimentin的蛋白表达明显增强(P<0.05)。结论: TRPC1通过调节E-钙黏蛋白和vimentin 的蛋白表达参与了TGF-β1诱导人支气管上皮细胞迁移的过程。

[关键词]转化生长因子β1； 人支气管上皮细胞； 细胞迁移； 瞬时受体电位通道1

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组份参与的呼吸系统常见慢性多发病。气道炎症、气道高反应性和气道重塑是其主要三大病理特征，而其中气道重塑是和哮喘严重程度关系最为密切的因素[1]。气道上皮细胞结构和形态的改变，包括上皮细胞脱落和纤毛缺失、细胞之间的紧密连接和黏附连接破坏以及上皮细胞向间充质细胞转变(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，为气道重塑的重要标志。EMT可促使上皮型细胞失去细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，从而使上皮细胞获得较高的迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质等间质细胞的能力。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一种调节细胞生长、存活、分化和转移的转化生长因子，参与组织的纤维化、自身免疫性疾病和肿瘤的形成。研究证实，TGF-β1作为一种细胞外的生长因子，能在多种生理和病理条件下诱导EMT的发生，促使上皮细胞向间充质细胞转化，进而获得迁移和侵袭能力[2]。细胞内游离Ca2+作为细胞内特殊的第二信使与细胞迁移和侵袭等多种生理病理过程密切相关。经典瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel，TRPC)是非选择性阳离子通道，参与各种细胞的钙离子内流，特别是TRPC1参与形成钙库操纵性Ca2+内流(store-operated Ca2+entry，SOCE)，调节Ca2+浓度从而影响细胞的功能。有研究报道TGF-β1通过增加TRPC的表达调节胞外Ca2+的内流[3]，但在TGF-β1诱导的气道上皮细胞发生迁移和侵袭过程中是否有TRPC1的参与尚未见报道。本实验研究TRPC1通道是否参与TGF-β1诱导的支气管上皮细胞迁移和侵袭的发生和有关机制，为哮喘预防和临床治疗提供新的靶点。

材料和方法

1材料

1.1细胞系人支气管上皮细胞系16HBE由广州医科大学实验医学研究中心保存和复苏。

1.2主要试剂胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1640培养基购自Gibco；重组人TGF-β1购自R&D；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和E-钙黏蛋白抗体购自CST；vimentin多克隆抗体购自Abcam；Transwell共培养小室购自Corning；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo；β-actin抗体和ECL试剂盒购自杭州联科生物科技有限公司；TRPC1基因的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)序列由上海吉玛公司合成，正义链为5’-CCACCUGUAAGAA-GAUAAUTT-3’，反义链为5’-AUUAUCUUCUUACAGGUGGTT-3’。

2方法

2.1细胞培养10% FBS体外培养16HBE细胞，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。选择对数生长期细胞进行实验。

2.2细胞分组(1)正常对照组，1% FBS培养基培养细胞；(2)10 μg/L TGF-β1处理细胞组；(3)si-TRPC1单独处理细胞组；(4)si-TRPC1+10 μg/L TGF-β1组。

2.3CCK-8 法检测16HBE细胞的活力将对数生长期的细胞按每孔5×103个密度种于96孔板，实验分组同上，各设复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱。分别于12 h、24 h 和 48 h 后加入 CCK-8 试剂继续孵育2 h后酶标仪检测 450 nm吸光度(A)值。

2.4流式细胞术法检测细胞凋亡情况收集各组培养液(其中包含悬浮的死细胞)，用胰酶消化细胞，用移液管将细胞吹散。将 5×105细胞重悬于100 μL binding buffer 中，加入 8～10 μL Annexin V-FITC 试剂，混匀，避光室温反应 10～15 min，补加binding buffer至400 μL；流式细胞仪上机前新鲜加入 5 μL (50 mg/L) PI后测定，激光光波波长为488 nm，发射光波波长大于630 nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

2.5迁移能力检测(1)划痕实验：取第3代细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到100%后，用消毒后的200 μL枪头在6孔板中划出3～5条无细胞的伤痕，用PBS清洗漂浮的细胞后加入按上述分组方式分组的完全培养基，于12 h、24 h和48 h后显微镜拍照。(2)Transwell小室实验：采用24孔Transwell小室(8.0 μm)。Transwell小室底部预先用40 μL的1∶5稀释基质Matrigel胶包被。分组同前，用无血清培养基培养24 h后，调整细胞浓度为1×105个，将200 μL的各组细胞悬液加入到上室中，同时下室加入500 μL的含有10% FBS的1640培养基，24 h后取出，PBS洗涤以4%多聚甲醛固定30 min，棉签擦去上室未迁移的细胞。自然风干后用结晶紫染色30 min，倒置显微镜下观察5个视野中迁移至聚碳酸酯微孔膜下表面的细胞数。

2.6Western blot实验将处理后的细胞用PBS洗涤后提取细胞总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度后按每孔30 μg上样，10% SDS-PAGE分离蛋白，恒流280 mA，2 h转移到PVDF膜上，封闭1 h，分别与抗E-cadherin、vimentin抗体和β-actin抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后 II 抗室温孵育1 h，洗涤后用增强化学发光(ECL)试剂盒检测信号强度。

3统计学处理

以上实验均重复3次，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用 SPSS 17.0 统计软件分析。计量资料间的比较在确定方差齐后采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组间的多重比较采用SNK-q检验；如果方差不齐则采用 Welch 法，组间多重比较采用 Dunnett’s T3 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结果

1TGF-β1诱导16HBE细胞发生迁移

用TGF-β1(10 μg/L)刺激16HBE细胞，与对照组比较，TGF-β1刺激后，细胞划痕实验显示16HBE细胞迁移能力明显增强，大量细胞迁入划痕区。随机选取每组细胞3个区域测划痕宽度和迁移距离进行数据统计，TGF-β1作用后迁移距离明显增加(P<0.01)，见图1。

2siRNA沉默TRPC1对TGF-β1诱导的16HBE细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果显示，siRNA沉默TRPC1基因24 h，再用TGF-β1刺激细胞24 h或48 h，由TGF-β1诱导的细胞迁移距离明显受到抑制，与TGF-β1组比较显著减少(P<0.01)，见图1。

Figure 1.The effect ofTRPC1 silencing on the migration ability of 16HBE cells induced by TGF-β1. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group.

图1siRNA沉默TRPC1对TGF-β1诱导的16HBE细胞迁移能力的影响

3siRNA沉默TRPC1对细胞活力的影响

取第3代16HBE细胞加不同处理因素分别培养12 h、24 h和48 h，结果显示TGF-β1组和si-TRPC1组以及si-TRPC1干扰后加TGF-β1处理组细胞活力与对照组比较均无显著差异，见图2。

4siRNA沉默TRPC1对细胞凋亡的影响

用流式细胞术检测细胞凋亡，与对照组相比，TGF-β1组和siRNA沉默TRPC1组对16HBE细胞凋亡数目的百分比均无显著改变，见图3。

Figure 2.The effect ofTRPC1 silencing on the activity of 16HBE cells induced by TGF-β1. Mean±SD.n=4.

图2siRNA沉默TRPC1对TGF-β1诱导16HBE 细胞活力的影响

Figure 3.The effect ofTRPC1 silencing on the apoptosis of 16HBE cells induced by TGF-β1. Mean±SD.n=4.

图3siRNA沉默TRPC1对16HBE 细胞凋亡的影响

5siRNA沉默TRPC1对TGF-β1诱导的16HBE细胞侵袭能力的影响

Transwell实验中TGF-β1刺激24 h和48 h后，与对照组比，细胞迁移穿孔数量明显增加(P<0.01)；先沉默TRPC1再给TGF-β1刺激后，由TGF-β1诱导的细胞穿孔数目的增加明显受到抑制，与TGF-β1组比较显著减少(P<0.01)，见图4。

Figure 4.The effect ofTRPC1 silencing on the invasion ability of 16HBE cells induced by TGF-β1. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group.

图4siRNA沉默TRPC1对TGF-β1诱导的16HBE细胞侵袭能力的影响

6siRNA沉默TRPC1对E-钙黏蛋白和vimentin蛋白表达的影响

Western blot检测结果示，TGF-β1诱导细胞48 h后，E-钙黏蛋白表达量明显降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；siRNA沉默TRPC1 24 h再用TGF-β1刺激细胞48 h，由TGF-β1诱导的E-钙黏蛋白表达量的减少受到抑制，与TGF-β1组比较显著增加(P<0.05)，见图5。

Figure 5.The effect ofTRPC1 silencing on E-cadherin protein expression in 16HBE cells induced by TGF-β1. The relative expression level of E-cadherin protein was normalized to β-actin protein in the same sample. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

图5siRNA沉默TRPC1基因对TGF-β1诱导的16HBE细胞E-钙黏蛋白表达的影响

TGF-β1作用于16HBE细胞48 h后，与对照组相比较，vimentin蛋白表达量显著增加(P<0.01)。用siRNA沉默TRPC1 24 h再用TGF-β1刺激细胞48 h，由TGF-β1诱导的vimentin蛋白表达量增加受到抑制，与TGF-β1组比较显著减少(P<0.05)，见图6。

Figure 6.The effect ofTRPC1 silencing on vimentin protein expression in 16HBE cells induced by TGF-β1. The relative expression level of vimentin protein was normalized to β-actin protein in the same sample. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

图6siRNA沉默TRPC1基因对TGF-β1诱导的16HBE细胞vimentin表达的影响

讨论

支气管哮喘是由环境、遗传及其它因素共同作用而引起的常见的慢性气道炎症性疾病，目前经典的激素类药物抗炎和支气管扩张药平喘治疗能缓解哮喘患者的临床症状，控制哮喘的急性发作，但部分哮喘患者仍出现不同程度的不可逆性气流阻塞，这被认为是由气道重塑所致。因此，研究气道重塑方面的机制对于哮喘的预防和治疗具有重要的现实意义。

在正常状态下，气道上皮受到损伤后，发生代偿性增生反应，弥补气道损伤后脱落的细胞，促进气道上皮的修复。目前认为上皮细胞受损后可分泌多种细胞因子如TGF-β1/β2、EGF、ET-1、PDGF等刺激上皮下的成肌纤维细胞和平滑肌细胞增生，后2种细胞亦可分泌多种细胞因子影响上皮细胞增殖，它们相互作用最终导致气道重构。TGF-β1是一种调节细胞生长、分化和迁移的转化生长因子，参与组织的纤维化、肿瘤及自身免疫性疾病的形成。同时TGF-β1对细胞增殖有多重效应，其效应细胞的不同以及TGF-β1应用的浓度不同而有差异。如对于指数增生期的前列腺基质细胞，TGF-β1可抑制其增殖，其抑制效应随TGF-β1浓度的增加而增强。对于平顶期的前列腺基质细胞，低浓度(<0.1 μg/L)的TGF-β1表现为刺激增殖作用，而高浓度(>1 μg/L)的TGF-β1无显著刺激增殖作用。高浓度的TGF-β1可诱使前列腺成纤维细胞向平滑肌细胞的分化，而非促进平滑肌细胞的增殖。在重症哮喘患者中，TGF-β1能抑制表皮生长因子对气道上皮细胞的增殖反应，从而影响上皮修复过程。本研究中我们检测TGF-β1对16HBE细胞生长活力影响，发现给予 10 μg/L TGF-β1细胞未见明显增殖，并且我们沉默TRPC1后发现，细胞活力未受到沉默TRPC1干扰的影响。

EMT是指在胚胎发育、组织纤维化或肿瘤转移等过程中发生的上皮细胞黏附性丢失，转变成间质细胞而获得迁移能力的的现象。Zhang等[4]的研究发现气道上皮细胞在TGF-β1作用下发生EMT，参与了气道重塑和气道高反应性的发生发展，进而参与哮喘发病过程。研究发现组织TGF-β1表达增加，导致上皮性标志物E-钙黏蛋白表达明显下降，间质性标志物vimentin表达明显增多，结果使得细胞骨架重排，上皮细胞变得类似于成纤维细胞，引发EMT，从而增强了迁移和侵袭能力[5]。EMT发生过程中，上皮细胞失去极性，细胞间黏附丧失，产生细胞运动性结构，使细胞获得活动能力，从而具有侵袭性。研究发现，E-钙黏蛋白主要表达于上皮细胞，它可以通过维持细胞-细胞间的连接从而阻止上皮细胞发生迁移和侵袭[6]。在大多数癌组织中E-钙黏蛋白的表达及功能都有缺失，而且通过激活E-钙黏蛋白的表达可以减少肿瘤细胞的迁移和侵袭。在细胞培养或转基因小鼠的肿瘤模型中敲除E-钙黏蛋白基因可以诱导EMT的发生和恶性肿瘤的发展及迁移[7]。上皮细胞E-钙黏蛋白的缺失被认为是细胞失去极性和具有迁移能力的重要标志。波形蛋白(vimentin)是存在于间充质细胞中的一种中间丝蛋白，表达于间充质细胞，如成纤维细胞和内皮细胞等，它可以调节细胞骨架蛋白和细胞黏附分子等蛋白间的相互作用，参与细胞的迁移、侵袭、黏附和信号转导过程[8]。Vimentin作为间质细胞的标志分子表达上调导致迁移和侵袭能力显著增强。Zhao等[9]研究发现，在分化程度低的癌细胞中转染反义vimentin的载体后，癌细胞的侵袭和迁移能力明显降低。本实验结果显示细胞上皮标记物E-钙黏蛋白的蛋白表达在TGF-β1处理后减少，而间质标记物vimentin的蛋白表达在TGF-β1处理后增加，说明TGF-β1能诱导支气管上皮细胞发生EMT。用siRNA沉默TRPC1后，相对于TGF-β1组，沉默TRPC1后再予TGF-β1刺激细胞后发现，由TGF-β1诱导的E-钙黏蛋白的蛋白表达减少受到抑制。相反，siRNA沉默TRPC1后由TGF-β1诱导的vimentin蛋白的增加也受到抑制，表明TRPC1可能通过上调E-钙黏蛋白和抑制vimentin蛋白表达参与TGF-β1诱导的16HBE细胞的迁移。

细胞迁移是指在外界迁移信号或趋化物刺激下引发的细胞移动，它是生命活动最基本的功能之一，是机体生理和病理过程中的一个重要环节。Ca2+作为特殊的第二信使，在调控细胞迁移、侵袭、周期、分化和增殖等病理生理过程中起着重要的作用。细胞膜的钙库操纵性钙通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)介导的SOCE是支气管上皮细胞等非兴奋细胞产生Ca2+内流的主要方式。SOCC由STIM1、Orai1和TRPC家族组成，钙释放激活钙调节子1(calcium release-activated calcium modulator 1，CRCM1/Orai1)和TRPC是细胞膜SOCC的重要组成部分[10]。基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)仅存在于内质网膜，在钙池消耗后，它作为一种钙池信号感受蛋白，感受钙池充盈状态并聚集成斑点向细胞膜移动靠近，并通过N基端与细胞膜上的SOCC通道(Orai1/TRPC)相互作用而开放钙通道，形成SOCE[11-12]。Abdullaev等[13]研究发现沉默内皮细胞TRPC1基因表达能下调SOCE，反之，TRPC1蛋白表达增多，钙离子内流增加，细胞内自由Ca2+浓度升高[14]。TGF-β1作用细胞后引起的胞浆内钙离子浓度的升高被认为是通过STIM1/Orai1激活了SOCC。本课题组已经证实TRPC1在16HBE细胞上广泛表达，且TGF-β1作用后TRPC1表达明显增加[15]，这说明SOCE很可能参与了TGF-β1诱导的16HBE细胞的EMT，TRPC1在TGF-β1诱导人支气管上皮细胞EMT过程中发挥了重要作用。因此，研究TRPC1通道与气道上皮细胞迁移的关系具有重要的意义和应用前景。

为证实TRPC1通道参与气道上皮细胞迁移的作用，本实验首先用TGF-β1(10 μg/L)作用于16HBE细胞，发现细胞迁移能力明显增强。CCK-8法检测细胞未见活力明显增加，证实TGF-β1可以诱导16HBE细胞发生迁移，且不影响细胞活力。而且也证实siRNA沉默TRPC1基因对TGF-β1诱导的16HBE细胞的凋亡无影响。迁移和侵袭实验结果表明siRNA沉默TRPC1基因可致TGF-β1诱导的16HBE细胞的迁移和侵袭能力受到抑制。本实验用siRNA沉默TRPC1基因，观察到其对EMT起抑制作用，我们推测TRPC1可通过参与TGF-β1诱导的16HBE细胞EMT过程而影响迁移。当然，有无其它信号通路参与这一过程，还有待进一步探讨。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Effects of TRPC1 on TGF-β1-induced migration of human bronchial epithelial cellsZHONG Chang-jiang, YUE Xi-lei, LI Jian-hua, XU Ji-de, CHENG Ying, YANG Chun-tao

(DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China.E-mail:xujide@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of canonical transient receptor potential channel 1 (TRPC1) in the migration of human bronchial epithelial cells (16HBE) induced by transforming growth factor-β1 (TGF-β1). METHODS: Silencing ofTRPC1 gene expression was performed by siRNA. The cell activity and apoptosis were measured by CCK-8 assay and flow cytometry, respectively. The migration and invasion abilities of the 16HBE cells were detected by wound- healing assay and Transwell assay. The protein expression of E-cadherin and vimentin was determined by Western blot. RESULTS: TGF-β1 treatment significantly enhanced the cell migration distance compared with control groups (P<0.01). The results of CCK-8 assay and flow cytometry indicated that there were no significant difference in proliferation and apoptosis amongTRPC1 siRNA group, TGF-β1 group and control group (P>0.05). The results of wound-healing and Transwell assays showed that migration and invasion abilities inTRPC1 siRNA + TGF-β1 group were markedly suppressed compared with TGF-β1 group (P<0.01). The protein expression of E-cadherin and vimentin induced by TGF-β1 was inhibited byTRPC1 silencing compared with TGF-β1 group (P<0.05). CONCLUSION: TRPC1 is involved in the migration of human bronchial epithelial cells induced by TGF-β1 through regulating the protein expression of E-cadherin and vimentin.

[KEY WORDS]Transforming growth factor-β1; Human bronchial epithelial cells; Cell migration; Transient receptor potential channel 1

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.013

[中图分类号]R332； R562.25

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 020-37103210; E-mail: xujide@163.com

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No.81470205)

[收稿日期]2015- 07- 27[修回日期] 2015- 10- 19

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0267- 06

#现工作单位：黄石市中心医院