刘红杰　王钢

摘要：目的 观察健步通络熏蒸液对兔膝骨关节炎关节软骨中细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）表达的影响，探讨其关节软骨保护作用机制。方法 26只新西兰大白兔，随机抽取6只作为空白组，余20只采用改良Hulth法制作骨关节炎模型，术后4周随机抽取2只验证造模是否成功，18只随机分为模型组、熏洗组和降钙素组。模型组采用自来水熏洗，熏洗组采用健步通络熏蒸液熏洗，每次30 min，每日1次；降钙素组给予降钙素5 U/kg肌肉注射，每日1次，疗程20 d。疗程结束后行空气栓塞致死，取关节软骨观察其大体形态，PCR检测软骨中ERK1/2含量。结果 与空白组比较，模型组关节面损伤严重，ERK1/2含量显著升高；熏洗组和降钙素组关节面损害较轻，且ERK1/2表达降低；熏洗组与降钙素组比较，2组关节面损害及ERK1/2表达无明显差异。结论 健步通络熏蒸液对膝骨关节炎关节软骨具有保护、抑制软骨退变的作用，其机制可能与抑制ERK1/2表达有关。

关键词：健步通络熏蒸液；骨关节炎；关节软骨；细胞外信号调节激酶1/2；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.018

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0063-04

Effects of Jianbu Tongluo Fumigation Fluid on Expression of ERK1/2 in Articular Cartilage of Rabbit Knee Osteoarthritis LIU Hong-jie1， WANG Gang2 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Jianbu Tongluo Fumigation Fluid on the expression of extracellular signal-regulated kinase1/2 in articular cartilage of rabbit knee osteoarthritis； To discuss its related mechanism of action. Methods Six New Zealand white rabbits were randomly selected among 26 as blank group and 20 were made into osteoarthritis models by modified Hulth method. After four weeks， two rabbits were chosen to verify whether modeling was successful； 18 were randomly divided into model group， fumigation group and calcitonin group. The rabbits in model group and fumigation group were fumigated with water and Jianbu Tongluo Fumigation Fluid respectively， 30 min each time， 1 time a day. The rabbits in calcitonin group were treated with calcitonin intramuscular injection of 5 U/kg， 1 time a day. The treatment lasted twenty days. After twenty days， all rabbits were sacrificed through air embolism. The general configuration of articular cartilage was observed and PCR technique was used to detect the content of ERK1/2. Results Compared with the blank group， joint surface damage in the model group was more serious and the content of ERK1/2 increased. Joint surface damage in the fumigation group and calcitonin group was relative light， and the expression of ERK1/2 decreased in articular cartilage. Calcitonin group and fumigation group had no significant difference in joint surface damage and the expression of ERK1/2. Conclusion Jianbu Tongluo Fumigation Fluid can protect and inhibit the cartilage regression of knee osteoarthritis， and the mechanisms is associated with inhibition the expression of ERK1/2.

Key words： Jianbu Tongluo Fumigation Fluid； osteoarthritis； articular cartilage； extracellular signal-regulated kinase1/2； rabbits

基金项目：甘肃省自然科学研究基金计划（1212RJZA087）

通讯作者：王钢，E-mail：lhjtwq@163.com

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的老年性关节软骨退行性改变的疾病，发病率逐年升高，膝关节最为常见。其中特征性、最基本的病理改变是关节软骨的变性，加之骨赘形成、滑膜炎症，从而导致一系列与之相关的临床症状。OA属中医“痹证”“痿证”范畴。中医治疗OA历史悠久，方法各异。健步通络熏蒸液为甘肃中医药大学附属医院院内制剂，临床观察其具有治疗OA的作用[1]。本实验采用改良Hulth法制作OA模型，观察健步通络熏蒸液对关节软骨细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）表达的影响，探讨其相关作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

4～6月龄新西兰大白兔26只，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg，兰州军区总医院动物实验科，合格证号SCXK-（军）2012-0020，分笼饲养，自由喂食。

1.2 药物

健步通络熏蒸液由透骨草20 g、伸筋草30 g、桑寄生30 g、杜仲30 g、羌活20 g、独活20 g、川牛膝15 g、红花15 g、当归10 g、赤芍10 g、川芎15 g、乳香20 g、没药20 g、制川乌10 g、制草乌10 g、土鳖虫10 g、山楂10 g、五味子15 g等组成，饮片由甘肃中医药大学附属医院药剂科提供。降钙素，山东绿叶制药有限公司，批号2013075。

1.3 主要试剂与仪器

RT-RCR试剂盒（DBI公司），Trizol试剂（Invitrogen life technologies）。PCR仪（BIO-RAD S1000 Thermal Cycler公司），凝胶成像分析仪（Biobad），电泳仪（BIO-RAD公司），Q500微量紫外可见分光光度计（美国Quawell），HH.WZL.Cr42Ⅱ型电子恒温三用水箱（汕头市医用设备厂），自制动物熏蒸装置。

2 实验方法

2.1 造模

采用改良Hulth法制作OA模型[2]。术前常规备皮，3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，取兔膝关节内侧入路，切断兔膝关节内侧副韧带和前交叉韧带，切除内侧半月板。术后连续1周予青霉素20万U肌肉注射，1周后每日被动驱赶兔子活动30 min，连续4周。

2.2 分组

造模4周后，从20只造模的膝骨关节炎兔中随机选取2只，行大体形态观察及病理切片以验证造模是否成功，余18只随机分为模型组、熏洗组、降钙素组，每组6只。另选6只作为空白组。

2.3 干预

空白组、模型组常规喂养，模型组、熏洗组均采用恒温水箱进行熏洗，模型组采用自来水进行熏洗，熏洗组采用健步通络熏蒸液进行熏洗。根据人和动物等量换算公式计算药物用量。将每剂中药治疗前加水500 mL浸泡30 min后，放入电饭锅加热，煮沸后再煮15 min。然后将药汁倒入电恒温水箱内，将药汁温度控制在40 ℃，将预先准备的笼屉放在电恒温水箱上预热10 min，将兔放入笼屉中，熏洗组每次30 min，每日1次，共20 d。降钙素组给予降钙素5 U/kg肌肉注射，每日1次，共20 d。

2.4 标本采集

干预结束后各组动物行空气栓塞法处死，切开右侧后肢膝关节囊，显露关节软骨，取右后肢内侧股骨髁关节面软骨，软骨标本生理盐水冲洗表面血迹后立即放入液氮中备用。

2.5 观察指标

2.5.1 关节软骨组织大体形态观察 肉眼观察右后肢股骨髁关节软骨的变化情况，参照Pelletier JP[3]标准进行评分。0分：关节面透明光整、色泽正常；1分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰黯；2分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表层和中层；3分：关节面有溃疡，缺损深达软骨深层；4分：软骨剥脱，软骨下骨质暴露。

2.5.2 关节软骨电镜观察 标本生理盐水冲洗表面血迹后放入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，15%乙二胺四乙酸脱钙液进行脱钙（每周更换1次脱钙液），28 d后，石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察关节软骨变化。参照Mankin's评分标准评分，见表1。

2.5.3 细胞外信号调节激酶1/2表达检测 采用Trizol提取软骨组织中总RNA，先后检测RNA纯度浓度，根据A260/A280比值为1.8～2.0及28 s、18 s的亮度比值，估测RNA质量。RNA反转录为cDNA包括RNA变性、反转录反应及PCR检测基因片段。最终进行凝胶成像分析，应用Quantity one 4.61软件分析系统进行灰度分析，计算相对灰度（目的基因灰度值÷β-actin灰度值×100%），分析所检测基因的相对表达量。ERK1/2的引物设计由生工生物工程（上海）股份有限公司设计，见表2。

3 统计学方法

采用SPSSl7.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 大体形态观察

空白组关节软骨外观正常，软骨表面光滑，颜色正常，无关节面溃疡及软骨下骨质暴露；模型组可见关节软骨表面粗糙不平，颜色偏黯，软骨缺损糜烂并可见关节边缘有大量骨赘形成；降钙素组和熏洗组软骨损害较模型组轻，软骨表面欠光滑，个别区域颜色偏黯，可见少量骨赘。与空白组比较，造模组关节软骨破坏程度严重（P<0.05）；与模型组比较，降钙素组和熏洗组关节软骨破坏较轻（P<0.05）；而降钙素组与熏洗组比较，破坏程度无显著差异（P>0.05）。结果见表3。

4.2 电镜观察结果

与空白组比较，模型组软骨表面破损，裂隙四周可见大量细胞克隆现象，细胞数量减少且排列无序，基质染色非常不均，个别软骨细胞核消失。熏洗组和降钙素组关节软骨的损伤程度介于二者之间，即软骨表面不规则，变薄、粗糙，软骨细胞数量正常、分布欠规则，基质染色比较均匀。结果见表4、图1。

4.3 健步通络熏蒸液对兔关节软骨中细胞外信号调节激酶1/2表达的影响

模型组关节软骨中ERK1/2 mRNA的表达明显高于空白组（P<0.05）；与模型组比较，降钙素组和熏洗组ERK1/2 mRNA表达降低（P<0.05），降钙素组和熏洗组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表5、图2。

5 讨论

健步通络熏蒸液由伸筋草、制川乌、乳香、没药等组成，具有舒筋活血、补益肝肾、祛风除湿、活血消肿之功。其中伸筋草在《本草拾遗》中记载：“主人久患风痹，脚膝疼冷，皮肤不仁，气力衰弱。”现代药理研究表明，伸筋草具有免疫调节、清除自由基等作用，其复方制剂酊剂、乳膏剂均能治疗关节炎等[4]。制川乌在《长沙药解》中记载“其性疏利迅速，开通关腠，驱逐寒湿之力甚捷”。现代药理研究表明，川乌有抗炎、镇痛、免疫调节、抗肿瘤强心作用[5]。乳香、没药活血行气止痛，现代药理研究表明，二者配伍能抑制血小板聚集，增强活血化瘀的功效[6]。

本实验结果显示，空白组较模型组ERK1/2 mRNA 表达呈上升趋势，提示ERK1/2参与OA关节软骨的破坏。范氏等[7]亦发现，ERK参与软骨细胞的增殖、分化及肥大，阻断ERK通路可降低骨关节炎关节软骨的破坏，抑制软骨细胞的增殖，从而减轻软骨损伤、钙化和骨赘的形成，延缓病情的发展。本实验采用健步通络熏蒸液干预兔OA模型，发现其能抑制ERK1/2 mRNA表达，改善关节软骨的损伤，延缓OA的病程进展。但本实验的样本量少，难以保证实验的可靠性，在以后的研究中应扩大样本量，提高实验的科学性。OA发病机制十分复杂，受多种信号通路的影响，而ERK1/2只是其中之一。

参考文献：

[1] 王琳，戴恩来，王钢，等.基于影像学的健步通络熏蒸液治疗膝关节骨性关节炎疗效评价[J].中国中医药信息杂志，2012，19（9）：83-84.

[2] HULTH A， LINDBERG L， TELHAG H. Experimental osteoarthritis in rabbits preliminary report[J]. Acta Orthop Scand，1970，41（5）：522-530.

[3] PELLETIER J P， JOVANOVIC D， FERNANDES J C， et al. Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase[J]. Arthritis Rheum，1998，41（7）：1275-1286.

[4] 张志勇，陈华，杨小莹，等.伸筋草及其制剂的研究进展[J].中国药师， 2014，12（3）：474-477.

[5] 曹国琼，张永萍，徐剑，等.乌头的药理与毒理作用及减毒的研究进展[J].贵州农业科学，2013，41（2）：61-64.

[6] 蒋海峰，宿树兰，欧阳臻，等.乳香、没药提取物及其配伍对血小板聚集与抗凝血酶活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（19）：160- 165.

[7] 范素芳，王文雅，张柳.丝裂原活化蛋白激酶信号通路对骨关节炎软骨的作用[J].中国组织工程研究，2012，16（37）：7015-7019.

（收稿日期：2015-03-24）

（修回日期：2015-04-27；编辑：华强）