李肖甫，邱　翠，智艳芳，李　雅，荣守华，樊婷婷

郑州大学第三附属医院细胞室 郑州 450052

△男，1964年7月生，硕士，教授，研究方向:肿瘤细胞病理学诊断，E-mail:lixiaofu1964@163.com



HPV-16 L1甲基化和HPV E6/E7 mRNA检测宫颈病变的临床价值*

李肖甫△，邱翠，智艳芳，李雅，荣守华，樊婷婷

郑州大学第三附属医院细胞室 郑州 450052

△男，1964年7月生，硕士，教授，研究方向:肿瘤细胞病理学诊断，E-mail:lixiaofu1964@163.com

关键词人乳头瘤病毒；宫颈病变；HPV-16 L1甲基化；HPV E6/E7 mRNA

摘要目的：探讨HPV-16 L1甲基化程度、HPV E6/E7 mRNA表达水平在检测宫颈病变中的临床价值。 方法：选择50例HPV-16感染患者的宫颈脱落细胞学标本，其中CIN1 11例、CIN2 11例、CIN3 21例、宫颈鳞癌(SCC)7例，另取11例病理检测HPV-16阴性或慢性炎症者为对照。采用甲基化敏感性高分辨溶解曲线法检测HPV-16 L1甲基化水平，采用bDNA技术检测HPV E6/E7 mRNA的表达情况。 结果：对照组、CIN1组、CIN2组、CIN3组和SCC组HPV-16 L1甲基化阳性率分别为9.1%、72.7%、81.8%、90.5%、100.0%，HPV E6/E7 mRNA阳性率分别为45.5%、72.7%、90.9%、100.0%、100.0%；CIN2以上病变中HPV-16 L1甲基化阳性率均高于对照组，而CIN3以上病变中HPV E6/E7 mRNA阳性率均高于对照组(P均<0.005)。HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平均随宫颈病变严重程度的增加而升高(rS=0.638和0.525，P均<0.001)；HPV-16 L1甲基化程度与HPV E6/E7 mRNA表达水平呈正相关(rS=0.420, P=0.001)。结论：HPV-16 L1甲基化与HPV E6/E7 mRNA检测在分流HPV感染或细胞学阳性患者方面具有良好的临床应用前景。

AbstractAim: To evaluate the clinical value of HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA testing for the detection of cervical lesions.Methods: Fifty cervical cytology samples(11 cases of CIN1, 11 cases of CIN2, 21 cases of CIN3 and 7 cases of SCC). Another 11 samples with histology-negative or chronic inflammation were used as control. The HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA levels were detected using MS-HRM assay and bDNA technique, respectively.Results: The overall positive rates of HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA for control, CIN1,CIN2,CIN3 and SCC groups were 9.1%,72.7%,81.8%,90.5%,100.0% and 45.5%,72.7%,90.9%,100.0%,100.0%, respectively. The HPV-16 L1 methylation positive rate in CIN2+groups was higher than that of control group, while the HPV E6/E7 mRNA positive rate in CIN3+groups was higher than that of control group(all P<0.005). The HPV-16 L1 methylation degree and HPV E6/E7 mRNA level increased with the severity of cervical lesions(rS=0.638,0.525, all P<0.001). Additionally, the HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA level had positive correlation (rS=0.420,P=0.001).Conclusion: The HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA testing may have good applied prospect for the triage of women with HPV-infection or cytology-positive in clinical practice.

宫颈癌是威胁女性健康的第三大恶性肿瘤[1]。高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)持续感染是宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宫颈癌发生的主要病因[2-3]。目前已经发现有40种HPV亚型能入侵生殖器官，其中最主要的是HPV-16型，据统计，约50%的宫颈癌病例中能够发现此型HPV[4]。目前，临床上用于宫颈癌筛查的主要手段是宫颈液基薄层细胞学检查(thinprep cytologic test，TCT)联合HR-HPV DNA检测，但这两种方法反映的仅是宫颈当前的病理状态，并不能预测宫颈病变的进展及回退。因此，寻找筛查高危宫颈病变的新的生物标志已成为一个研究热点。近期研究[5]显示HPV-16 L1有望成为分流HPV感染患者的良好的生物标志物。此外，高危型HPV癌基因E6和E7的表达对于恶性肿瘤的转化和维持起着重要作用，监测HPV E6/E7 mRNA的表达具有非常重要的意义[6]。该研究通过收集细胞学检查后剩余液基标本，分别采用甲基化敏感性高分辨溶解曲线法(methylation-sensitive high resolution melting，MS-HRM)检测HPV-16阳性患者HPV-16 L1甲基化水平，QUANTIVIRUS@HPV E6/E7 mRNA 3.0 Assay(b-DNA)法检测HPV E6/E7 mRNA的水平，评估这两个指标在检测宫颈病变中的临床价值。

1对象与方法

1.1研究对象选取2012年1月至2013年5月在郑州大学第三附属医院行常规TCT检查、经PCR分型检测确认为单纯HPV-16阳性且经随访阴道镜检查获得组织活检结果的患者50例，其中CIN1组11例，CIN2组11例，CIN3组21例，宫颈鳞癌(SCC)组7例；另取11例宫颈检查HPV-16阴性或慢性炎症者为对照。纳入研究的61例患者年龄25～76岁，中位年龄39岁。该研究获得了郑州大学第三附属医院生命科学伦理委员会批准。

1.2HPV-16 L1甲基化检测

1.2.1甲基化标准品的配制HPV-16 L1基因 100%甲基化标准和0%甲基化标准均根据目标序列合成，并克隆到E.coli(南京金思特科技有限公司)，两个标准品DNA浓度均由荧光定量PCR精确定量后，用0%甲基化标准品将100%甲基化标准品分别按比例稀释，配制成1%、10%、25%、50%和75% 5个甲基化程度的标准品，与0%、100%共计7个标准品，用于随后的MS-HRM检测。

1.2.2DNA提取和重亚硫酸盐修饰将TCT剩余标本4 000 r/min离心5 min，取适量沉淀物加入20 μL蛋白酶K，56 ℃水浴箱中过夜处理。提取的DNA经NanoDrop-2000超微量分光光度计(美国热电公司)定量检测后，取900 ng用于重亚硫酸盐修饰，EpiTect Bisulfite试剂盒购自德国Qiagen公司，操作严格按照说明书进行。所有修饰后的DNA及剩余TCT标本分别存放于-80 ℃和4 ℃冰箱。

1.2.3HPV-16 L1基因甲基化状态检测采用MS-HRM法。所测HPV-16 L1基因区域为nt5576～5636(NCBI 登记号：NC_001526.2)，相应特异甲基化PCR上游引物序列为5’-GCGCATTATTGTTGAT GTAGGTGATTTTTATTTATATTTTAG-3’，下游引物序列为5’-GCCGCACTAAACAACCAAAAAAACATC TAAAAAAAAATA-3’。PCR扩增体系：5.0 μL 2×EpiTect HRM PCR Master Mix，上、下游引物(10 mg/L)各0.6 μL，1.0 μL修饰后DNA，2.8 μL无菌水。PCR扩增条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s, 退火从60 ℃到52 ℃ 30 s(每个循环下降 0.2 ℃),72 ℃ 30 s,40个循环；72 ℃ 1 min。PCR产物经18 g/L凝胶电泳验证。扩增后，在LightCycler480上进行高分辨溶解曲线分析，条件为：95 ℃ 1 min, 40 ℃ 1 min, 65 ℃ 1 s, 以0.02 ℃/s的速度从72 ℃上升至95 ℃，收集溶解曲线数据，每1 ℃采集荧光25次，40 ℃ 冷却1 min。所有标本和标准品同时检测。最后，运行gene scanning程序，根据样本与标准品溶解曲线荧光值高低判断样本甲基化程度。以10%甲基化为临界点判定甲基化阳性率。

1.3HPV E6/E7 mRNA检测试剂盒购自科迪亚生物技术有限公司。采用bDNA法定量检测标本中HPV E6/E7 mRNA水平，具体按文献[7]操作：将TCT剩余标本3 000 r/min离心5 min后弃去上清，用2 mL去离子水洗涤后再次离心，弃上清，加入裂解液，放65 ℃恒温箱过夜；经配制检测缓冲液、布板、信号放大，上冷光仪检测，得标本、空白及阳性质控的发光值，用相关光单位(RLU)表示，将所得数据导入专用软件处理。当标本RLU和阳性质控的cutoff值≥1.00时，判定标本为阳性。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0处理数据。宫颈病变级别与HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平间，以及HPV-16 L1甲基化程度与HPV E6/E7 mRNA水平间的相关性采用Spearman秩相关分析，采用χ2检验比较不同级别宫颈病变组织中HPV-16 L1甲基化阳性率和HPV E6/E7 mRNA阳性率的差异。检验水准α=0.05。

2结果

2.1不同级别宫颈病变组织中HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平的比较所有标准品HPV-16 L1甲基化程度均被成功检测(图1)。HPV-16 L1甲基化程度随宫颈病变严重程度的增加而升高(rS=0.638,P<0.001)。HPV E6/E7 mRNA的水平随宫颈病变严重程度的增加而升高(rS=0.525,P<0.001)。

图1　MS-HRM方法检测HPV-16 L1不同甲基化程度标准品和标本的差异标准曲线图

2.2宫颈病变组织中HPV-16 L1甲基化程度与HPV E6/E7 mRNA水平间的关系HPV-16 L1甲基化程度与HPV E6/E7 mRNA水平呈正相关(rS=0.420,P=0.001)。

2.3不同宫颈病变HPV-16 L1甲基化阳性率和HPV E6/E7 mRNA阳性率比较见表1。

表1　不同宫颈病变HPV-16 L1甲基化

*：与对照组相比，P<0.005。

2.4不同检测方法诊断CIN2以上病变的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值见表2。

表2　不同检测方法诊断CIN2以上病变的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值　%

3讨论

有研究[8-9]指出，HPV DNA 的甲基化状态可以提示HPV感染者CIN2及以上瘤变。HR-HPV感染是宫颈癌发生的重要始动因素。在全球范围内，HPV-16型目前已经证实是宫颈癌中最常见的型别；HPV-16致癌性最强，且从最初感染到进展为宫颈癌的发病时间也相对其他类型的HR-HPV要短很多。HPV-16 L1壳蛋白具有较强的免疫原性，可诱导先天性或获得性免疫应答，有利于机体清除感染细胞。HPV-16 L1基因甲基化则在一定程度上可能影响L1壳蛋白的表达，使得其免疫效应弱化，最终导致宫颈疾病的发生和进展。因此，HPV-16 L1甲基化有望成为分流HPV感染患者的良好生物标志物。

近年来，人们对DNA甲基化认识不断提高，并研究开发了一系列检测DNA甲基化的方法。HPV基因组长7 000～8 000 bp，由于其基因组中没有典型的CpG岛，所以目前多采用特异位点甲基化的检测手段，就方法学而言各有其特点[10]。与其他方法相比，MS-HRM方法具有以下优点：①能够定量检测DNA甲基化程度。②高通量且能够减少工作量。③节约成本。④快速且敏感性高。作者选择MS-HRM作为检测方法，结果显示，HPV-16 L1甲基化程度随宫颈病变严重程度的增加呈上升的趋势，且CIN2以上病变组HPV-16 L1甲基化阳性率高于对照组，和以往研究[11]结果一致。

HPV的早期基因E6/E7编码的早期蛋白在宿主细胞中表达是导致宫颈癌的关键因素[12]，其机制可能为E6/E7蛋白抑制了抑癌基因p53和pRB[13-14]，引起细胞过度增殖，最终导致宫颈癌的发生[15]。因此，作为E6/E7蛋白翻译模板的mRNA的检测有利于区别短暂性HPV感染和高级别宫颈病变相关的HPV感染，较之DNA 检测特异性更高，也更具有临床指导意义[16]。

该研究采用的bDNA技术是一种三明治结构的核酸杂交方法。该方法采用bDNA分子放大捕获的目标RNA信号。该技术特点是检测样本不需呈指数增长的扩增过程，通过支链DNA和化学发光两种信号放大技术达到检测微量样本的能力，克服了传统的实时PCR技术中操作复杂、易污染的弊端。该研究结果显示，HPV E6/E7 mRNA的水平随宫颈病变级别的升高而升高，且CIN3以上病变组HPV E6/E7 mRNA的阳性率高于对照组，与上述理论及作者以往的研究[17]一致，也与有关研究[18-19]结果相似。

此外，该研究结果还显示：HPV-16 L1甲基化程度与HPV-16 E6/E7 mRNA水平呈正相关；在对CIN2以上病变检测时，两种方法及两种方法联合检测的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值间无明显差异，说明两种方法及两种方法联合对宫颈病变诊断具有相同作用。

综上所述，HPV-16 L1甲基化与HPV E6/E7 mRNA与宫颈癌病变关系密切，在分流HPV感染患者方面应具有良好的临床应用前景。HPV-16 L1甲基化检测或HPV E6/E7 mRNA检测可与HPV DNA检测互为补充，为妇科医师临床诊治HPV感染患者及评估临床疗效提供依据。

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(2015-04-22收稿责任编辑徐春燕)

*河南省科技厅基础科技攻关课题资助项目122300410036

Clinical value of HPV-16 L1 methylation and HPV E6/E7 mRNA testing in detection of cervical lesions

LIXiaofu，QIUCui，ZHIYanfang，LIYa，RONGShouhua，FANTingting

DepartmentofCytopathology,theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordshuman papillomavirus;cervical lesion;HPV-16 L1 methylation;HPV E6/E7 mRNA

中图分类号R737.3

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.012