顾有方，李文超，汪　凯，靳二辉，胡倩倩，李升和，陈会良

(安徽科技学院动物科学学院，凤阳 233100)



表达柔嫩艾美耳球虫HMGB1基因质粒DNA的免疫效果分析

顾有方，李文超，汪凯，靳二辉，胡倩倩，李升和，陈会良

(安徽科技学院动物科学学院，凤阳 233100)

摘要：旨在评价表达柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)HMGB1基因质粒DNA免疫对同源株攻虫的免疫保护效果。将EtHMGB1基因插入pcDNA3.1(-)/myc-His A真核表达载体中，并在Hela细胞中进行体外瞬时表达。设计了pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫组、pcDNA3.1(-)/myc-His A免疫组、重组蛋白质+FCA佐剂免疫组、pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组、FCA佐剂免疫组、未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组7个试验组。分别于14和21日龄对鸡进行两次免疫，28日龄时除未免疫未攻虫组外各组用1×104个E.tenella孢子化卵囊攻虫，以平均增重、卵囊产量和病变记分作为免疫保护效果的评价指标。结果显示，成功构建了pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1重组质粒，转染后该质粒可在Hela细胞中进行瞬时表达。该重组质粒单独免疫、重组蛋白质单独免疫或重组质粒与重组蛋白质联合免疫均对鸡肠道病变改善效果不明显，但可显著提高增重，降低卵囊产量，尤以重组质粒与重组蛋白质联合免疫效果最佳，显示Prime-boost免疫策略可提高该重组质粒的免疫保护效果。上述结果显示HMGB1可作为未来球虫疫苗研制的良好候选抗原之一。

关键词：柔嫩艾美耳球虫；高迁移率组蛋白；真核表达；免疫保护

鸡球虫病是严重危害养鸡业的一种原虫病，可造成鸡死亡、代谢障碍、饲料转化率降低、生长发育缓慢，产蛋率下降等。目前防治球虫病主要依靠药物，但是由于耐药虫株(甚至多重耐药虫株)的出现，公众对食品中药物残留的日益关注，研制新药成本费用高以及政府对抗球虫药使用的限制或禁止[1-2]，很多学者将目光转向用疫苗防治球虫病。传统的球虫疫苗尽管已应用多年，但存在规模化生产受限制，易散毒，潜在致病性威胁等缺点[3]，限制了其在生产中的使用。随着分子生物学技术的快速发展，研制亚单位重组疫苗或核酸疫苗已成为目前球虫疫苗发展的方向，但这依赖于球虫生活周期各阶段特异性保护抗原的鉴定[4]。

高迁移率组蛋白(high mobility group protein，HMG)是一组含量丰富，进化高度保守的核内非组蛋白。HMGB1作为HMG的重要成员之一，与多种疾病的发生、发展、转归之间关系密切，胞外的HMGB1是一种重要的炎症前调节因子，可以和LPS一样刺激炎症反应，引起宿主的免疫应答反应，在感染性免疫、自身性免疫及肿瘤免疫形成中起重要作用，是这些疾病潜在的治疗靶点[5-6]。最近的研究显示HMGB1是犬新孢子虫引起机体Thl型免疫应答的重要成员之一，其参与了激活TLR9而介导机体Thl型免疫应答，导致炎症的产生[7]。课题组从E.tenella转录组数据库中鉴别出了一个假定HMGB1基因，在克隆并原核表达该基因的基础上，作者又构建真核表达质粒，进而研究表达EtHMGB1基因质粒DNA的免疫保护作用，为进一步探索球虫HMGB1基因的功能及在鸡球虫病免疫预防中的应用奠定基础。

1材料与方法

1.1虫株、菌株、质粒和细胞株

E.tenella凤阳株、pcDNA3.1(-)/myc-His A真核表达载体和Hela细胞由本实验室保存；E.coliTop10 购自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD-EtHMGB1载体和表达pET28a-EtHMGB1的Rosetta(DE3)菌由本实验室构建保存。

1.2实验动物

1日龄固始鸡苗300只，购自凤阳当地孵化场，饲养于消毒后无球虫污染的铁丝笼中。饲料系自行配制，不含任何抗球虫药，饲喂前80 ℃烘烤2 h，饮用水为煮沸处理不含球虫卵囊的自来水。

1.3主要试剂

BamHⅠ、XhoⅠ、T4DNA 连接酶、DL2000 Marker等为TaKaRa公司产品；凝胶回收和质粒提取试剂盒为Biolux公司产品；FuGENE HD转染试剂为Roche公司产品；抗E.tenella阳性血清为本实验室自制，ELISA检测抗体效价在1∶12 800以上；HRP 标记的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)和FITC标记的羊抗鼠 IgG(FITC-IgG)为武汉博士德生物工程有限公司产品；Blue Plus Protein Marker为北京全式金生物技术有限公司产品。

1.4E.tenellaHMGB1基因的扩增

根据本室构建的含E.tenellaHMGB1全长基因的pMD-EtHMGB1质粒序列设计引物，P1：5′-GGATCCATGACGAGCAACAAGAGCAG-3′ (下划线序列为BamHⅠ酶切位点)，P2：5′-CTCGAGCTATTTGTGCTGCTTGTAGG-3′(下划线序列为XhoⅠ酶切位点)。然后以pMD-EtHMGB1质粒为模板，以P1、P2为引物，PCR扩增EtHMGB1基因。

1.5真核表达重组质粒的构建

EtHMGB1基因PCR扩增产物和pcDNA3.1(-)/myc-His A质粒分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收后连接、转化E.coliTOP10感受态细胞，PCR、双酶切和测序鉴定。鉴定正确的重组质粒，命名为pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1。

1.6pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1的体外瞬时表达与鉴定

按转染试剂盒操作说明书的方法将pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1转染于生长密度达到80%左右的Hela单层细胞。37 ℃，5% CO2培养42 h，固定细胞，以E.tenella阳性血清为一抗，以羊抗鼠FITC-IgG为二抗，做间接免疫荧光试验(IFA)检测。同时设pcDNA3.1(-)/myc-His A质粒转染Hela细胞及正常Hela细胞作对照组。

1.7表达产物Western blot分析

胰酶消化转染48 h的Hela细胞，同时取未转染质粒的正常细胞作对照，将细胞裂解物进行SDS-PAGE电泳转膜后，以E.tenella阳性血清为一抗，以羊抗鼠HRP-IgG为二抗，加入ECL发光液，X光曝光，显影，定影后分析鉴定。

1.8动物分组及免疫

雏鸡饲养至14日龄，剔除弱雏后，逐只编号，称重，随机分为7组，即pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫组，pcDNA3.1(-)/myc-HisA免疫组，重组蛋白质+FCA佐剂免疫组，pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组，FCA佐剂免疫组，未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组，每组20只鸡，各组体况和体重相近。各组均采用肌肉注射免疫，免疫前20 min于免疫部位预先注射0.2 mL的25%蔗糖溶液并按摩，然后同一部位注射相应剂量的重组质粒(或PBS)，21日龄时加强免疫1次。其中，pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组14日龄时用pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1质粒免疫，21日龄时用重组蛋白质免疫，未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组均用PBS进行免疫。28日龄时，除未免疫未攻虫组外，其余各组每只鸡均经口感染1×104个新鲜E.tenella孢子化卵囊，具体免疫和攻虫情况见图1。上述试验重复1次。

1.9免疫保护评价指标

攻虫前，各组鸡逐只称重，攻虫后每天观察鸡的精神、食欲、粪便与发病情况，从攻虫后第5天(33日龄)至第10天末(38日龄)，每天收集各组全部粪便，麦克马斯特法进行卵囊计数。攻虫后第7天末，每组剖杀10只鸡，参照J.Johnson等的方法[8]进行盲肠病变记分。攻虫后第10天末(38日龄)各组鸡逐只称重。用平均增重、卵囊产量和病变记分作为免疫保护效果的评价指标[2]。

1.10血清抗体水平检测

分别于一免、二免 (14和21日龄)及攻虫前(28日龄)随机从每组中选取5只鸡采血，分离血清，参照W.C.Li等[2]的方法用ELISA检测血清抗体水平。

1.11数据处理

运用SPSS13.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA analysis)中的Student-New man-Keuls Test，两两比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1EtHMGB1基因PCR

以重组质粒pMD-EtHMGB1为模板，扩增EtHMGB1基因，电泳显示在430 bp附近有一清晰条带，与预计大小相符(图2)。

2.2重组真核表达质粒的构建

构建的pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1重组质粒经PCR鉴定能扩增出预期目的条带，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，产生5 500和430 bp两条带，与预期相符，质粒经测序后进一步证实成功构建重组真核表达质粒。

2.3EtHMGB1在Hela细胞中的表达与鉴定

间接免疫荧光试验结果显示，转染pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1重组质粒的细胞中可见明显的绿色荧光，而转染pcDNA3.1(-)/myc-His A质粒或未转染的细胞中未见荧光(图3)，结果表明重组真核质粒pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1基因在Hela细胞中得到了表达。Western blot显示转染了pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1重组质粒的细胞可见到一条约16 ku的特异性表达条带。而未转染质粒的正常细胞中未见到条带(图4)，进一步证实了EtHMGB1蛋白在Hela细胞中得到了有效表达，而且其能被鼠抗鸡E.tenella球虫免疫血清识别，表明表达产物具有良好的反应原性。

2.4免疫保护效果

从表1可知，除pcDNA3.1(-)/myc-His A免疫组和FCA佐剂免疫组外，其余各疫苗免疫组体重获得与未免疫攻虫组相比均显著增加(P<0.05)，尤以pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组的体重获得增加最为明显，接近未免疫未攻虫组体重获得，但 pcDNA3.1(-)/myc-EtH-MGB1+重组蛋白质联合免疫组的体重获得与pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫组和重组蛋白质+FCA佐剂免疫组相比，差异均不显著(P>0.05)。各攻虫组在攻虫后均有不同数量的卵囊排出，其中以未免疫攻虫组、FCA佐剂免疫组和pcDNA3.1(-)/myc-His A免疫组排出量较多，三者之间差异均不显著(P>0.05)。其他各免疫组卵囊产量与未免疫攻虫组相比均显著下降(P<0.05)，其中以pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组卵囊产量下降最为明显，而且该组卵囊产量与重组蛋白质+FCA佐剂免疫组相比也差异显著(P<0.05)，但与pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫组相比无显著差异(P>0.05)。各免疫组的平均病变记分与未免疫攻虫组相比，虽有不同程度的降低，但差异均不显著(P>0.05)。

2.5血清抗体水平

以重组EtHMGB1蛋白作为检测用抗原，包被ELISA 板，间接ELISA 法对一免、二免 (14和21日龄)及攻虫前(28日龄) 收集的鸡血清中的IgG 进行测定，如图5所示，pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组IgG水平均显著高于pcDNA3.1(-)/myc-His A免疫组和重组蛋白质+FCA佐剂免疫组(P<0.05)。

表1表达EtHMGB1基因质粒DNA免疫经同源株攻虫后对鸡增重、病变记分和卵囊产量的影响

Table 1Effect of the plasmid encodingEtHMGB1 vaccination on body weight gain，fecal oocyst shedding，and lesion scores following oral challenge infection withE.tenella

同列中不同字母肩注表示差异显著(P<0.05)；相同字母肩注表示平均值差异不显著(P>0.05)

In the same column，the different capital letters mean significant difference (P<0.05)；The same capital letter means no difference(P>0.05)

3讨论

HMGB1以其多样的生物学效应及与多种疾病的发生、发展、转归之间的密切关系，受到人们越来越多的关注。但现有研究主要集中在对哺乳动物HMGB1蛋白方面，寄生虫HMGB1的研究刚刚起步，相关报道很少，主要着重于已发现HMGB1基因的克隆以及假定蛋白的确认等[9-11]，有关寄生虫HMGB1基因及其蛋白的功能，作用机制、释放、信号通路等却鲜有报道。

本课题组用生物信息学的方法，已鉴别了一个假定的E.tenellaHMGB1基因，该基因编码蛋白具有与属于顶复门原虫的新孢子虫HMGB1类似的结构域。研究证实球虫感染常会刺激机体细胞产生 IFN-γ等炎症因子，从而诱导机体Th1型免疫应答[12]，而NcHMGB1是犬新孢子虫引起机体Thl型免疫应答的重要成员之一[7]，是否球虫HMGB1与NcHMGB1一样具有诱发宿主的Thl型免疫应答的能力以及球虫HMGB1在球虫免疫中的作用大小，取决于球虫HMGB1是否是一个良好的保护性抗原。

球虫疫苗研究目前主要集中在核酸疫苗和重组蛋白质疫苗方面，尽管也取得了一些进展，但免疫效果还是不尽理想，因此改善免疫策略来提高球虫疫苗的免疫效果是未来球虫疫苗发展的方向之一[13]。研究显示，联合运用性质不同的核酸疫苗和重组蛋白质疫苗进行免疫接种可增强疫苗诱导的体液免疫应答和细胞免疫应答，从而有效地提高疫苗效果[14-15]。因此本研究在构建pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1真核表达质粒并在体外进行瞬时表达后，利用初免-加强(Prime-boost) 免疫策略进一步探讨了表达EtHMGB1基因质粒DNA的免疫保护作用。

本研究中，构建的pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1真核表达质粒转染Hela细胞后，IFA试验结果显示重组质粒在细胞中成功进行了瞬时表达，Western blot显示在Hela细胞中表达的EtHMGB1蛋白可被鼠抗鸡E.tenella球虫免疫血清识别，表明表达产物具有良好的反应原性。免疫保护试验的增重结果显示pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫组、重组蛋白质+FCA佐剂免疫组以及pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组的与未免疫攻虫组相比，体重增加均明显，尤其是pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组的体重增加最为明显，接近未免疫未攻虫组，表明重组质粒或重组蛋白质单独免疫均可显著降低攻虫对动物体重增加的影响，但重组质粒和重组蛋白质联合应用在体重增加上效果更好，分析其原因可能与Prime-boost免疫策略可发挥两种疫苗在机体内诱导免疫应答的不同优势，从而增强疫苗诱导机体产生特异性免疫应答的效果，进而通过改善攻虫鸡肠道生理状况，增加肠道的营养吸收能力或降低球虫的细胞毒性而发挥在增重方面的作用[2，16]。卵囊产量结果显示pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组卵囊产量下降最为明显，卵囊产量仅为未免疫攻虫组卵囊产量的21.11%，而且该组卵囊产量与重组蛋白质+FCA佐剂免疫组相比也下降显著。病变记分结果显示重组质粒或重组蛋白质单独免疫以及两者联合免疫对球虫感染鸡肠道损伤的改善作用均不明显，这一结果与吴绍强等[17]的结果一致，结合卵囊产量结果考虑，暗示重组质粒或重组蛋白质单独免疫或两者联合免疫可能对球虫子孢子/裂殖子入侵的抑制作用不明显，但可抑制球虫发育、繁殖，故导致球虫感染鸡肠道病变改善不明显，而卵囊产量下降明显，分析其原因可能与Prime-boost免疫策略增强了疫苗的抗生殖作用有关[18]。血清抗体水平检测结果也显示pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组诱导了较高抗体水平，显示Prime-boost免疫策略可提高机体的体液免疫应答水平，这一结果与J.Min等[19]的研究结果一致，但具体的作用机制还需要进一步的深入研究。

4结论

综合平均增重、卵囊产量和病变记分三个指标分析表明表达EtHMGB1基因的质粒DNA具有较好的免疫保护效果，HMGB1可作为球虫疫苗研制的良好候选抗原之一。

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(编辑白永平)

Protective Immunity Induced by a Plasmid EncodingEimeriatenellaHigh Mobility Groupbox1 Gene against Homologous Challenge

GU You-fang，LI Wen-chao，WANG Kai，JIN Er-hui，HU Qian-qian，LI Sheng-he，CHEN Hui-liang

(CollegeofAnimalScience，AnhuiScienceandTechnologyUniversity，Fengyang233100，China)

Key words:Eimeriatenella；high mobility group box1；eukaryotic expression；protective immunity

Abstract:This experiment was conducted to assess the immuno-efficacy of the eukaryotic plasmid.The high mobility group box1 gene fromEimeriatenellawas inserted into expression vector pcDNA3.1(-)/myc-His A，and then constructed the eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 and expressed transiently the objective protein in Hela cells.Seven experimental groups including pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 immunization group，pcDNA3.1(-)/myc-His A immunization group，recombinant antigen with adjuvant immunization group，pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 with recombinant antigen prime-boost immunization group，FCA adjuvant immunization group，unimmunized and challenged group and unimmunized and unchallenged group were designed.Chickens were vaccinated at the age of 14 and 21 days.All birds except the unchallenged control group were challenged orally with 1×104E.tenellasporulated oocysts at 28 days.Gain of body weight，fecal oocyst output and lesion scores were assessed as measures of protective immunity.The results showed that the plasmid pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 was successfully constructed，and the transient expression product ofEtHMGB1 could be detected by IFA and Western blot.Challenge experiments demonstrated that pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 immunization，recombinant antigen with adjuvant immunization and pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1 with recombinant antigen prime-boost immunization could all increase body weight gains and reduce oocyst excretion，but all three methods did not have an effect on cecal lesion.The prime-boost immunization strategy were superior to the other method based on the immune effects.These results suggest thatEtHMGB1 could be proposed as an anti-apicomplexan vaccine candidate.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.019

收稿日期：2015-07-23

基金项目：安徽省教育厅重大项目(KJ2014ZD09)；安徽省教育厅重点项目(KJ2015A189)；安徽省第七批“115”产业创新团队项目；安徽科技学院校级重点项目(ZRC2014406)；安徽科技学院重点学科项目(AKZDXK2015A04)

作者简介：顾有方(1964-)，男，安徽全椒人，教授，博士，主要从事动物寄生虫病研究，Tel：0550-6732036，E-mail：youfanggu@163.com

中图分类号：S852.723

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0354-07