胡　波，范志宇，王　芳，魏后军，宋艳华，仇汝龙，徐为中，薛家宾

(江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014)



兔出血症病毒衣壳蛋白P区二聚体的表达及其与受体结合能力分析

胡波，范志宇，王芳*，魏后军，宋艳华，仇汝龙，徐为中，薛家宾

(江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014)

摘要：为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)P区形成二聚体的能力及其与HBGAs受体结合的能力，作者以pMD19T-VP60为模板扩增包含铰链区H的P区基因(HP)并克隆至原核表达载体pET28a(+)中，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导表达，获得HP蛋白。经SDS-PAGE和Western blot检测，结果显示，HP蛋白主要以包涵体的形式高效表达，经HisTrap亲和柱纯化后可形成二聚体结构。通过HBGAs受体结合试验表明，P区与完整病毒衣壳相似，能与唾液中的HBGAs受体发生结合。本研究为进一步开展RHDV衣壳蛋白与受体的相互作用研究奠定基础。

关键词：兔出血症病毒；衣壳蛋白；P区；组织血型抗原；受体结合

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种烈性病毒性传染病，该病在全世界范围内广泛流行。RHDV属杯状病毒，无囊膜，为单股正链RNA病毒[1-2]。其含有两个开放阅读框(ORF)，衣壳蛋白VP60位于ORF1的3′端，基因长度为1 740 bp，编码579个氨基酸，是病毒衣壳的最基本的单位，与病毒的致病性和免疫原性密切相关[2]。180个VP60单体以二聚体的形式自聚成RHDV病毒样颗粒(VLPs)[2-3]。据X射线晶体研究[3]报道，VP60主要分为三个区域：NTA(N端臂，1—65 aa)、框架区(S区，66—229 aa)、突出区(P区，238—579 aa)和连接S与P区的铰链区(Hinge，230—237 aa)。S区形成VLPs的内壳，P区位于VLPs的外表面，形成VLPs的刺突结构[4]。P区是宿主抗体识别及靶向的主要区域，影响病毒的抗原性及病毒粒子与细胞受体的吸附作用，该区域序列具有较高的变异性[5-7]。

目前研究认为，组织血型抗原(HBGAs)是RHDV的结合受体[2]。K.Nyström等[8]比较了各基因型RHDV与各型HBGAs结合的关系，认为HBGAs是RHDV的结合因子，并促进病毒的感染。进一步研究发现，RHDV结合ABH组织血型抗原(HBGAs)，并能与合成的A型和H2型多糖发生特异性结合，且RHDV及其VLPs吸附成年兔呼吸道和消化道上皮细胞依赖于HBGAs的存在[8-9]。缺乏正确HBGAs配体的兔能够抵抗低剂量RHDV的攻击[8]。同属于杯状病毒的诺如病毒(NVs)与RHDV在晶体结构上十分相似，NVs在侵染时也能够特异性识别并结合HBGAs受体，其结合位点位于外表面的P二聚体或P亚区[10-13]，并通过唾液HBGAs结合试验证实不同基因型NVs与不同型HBGAs具有多种结合模式[14]。本研究构建表达含铰链区H的VP60 P区域，对其能否形成二聚体结构进行研究，并进一步分析其与受体HBGAs的结合能力，将为RHDV VLPs的结构与功能的进一步研究奠定基础。

1材料与方法

1.1质粒和菌株

质粒pMD19-T-VP60由本实验室构建并保存[15]；表达载体pET-28a(+)由本实验室保存；E.coliDH5α感受态、E.coliBL21(DE3)感受态购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2主要试剂和工具酶

DNA Marker DL2000及DL15000、pMD19-T载体、限制性内切酶NdeⅠ、HindⅢ、T4DNA连接酶、凝胶回收纯化试剂盒等购自TaKaRa公司；Pfx 高保真酶购自Invitrogen公司，酶标山羊抗小鼠IgG(HRP-IgG)购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，四甲基联苯胺(TMB)购自Sigma公司；96孔酶标反应板购自南京赛研生物技术有限责任公司；抗VP60 P区单克隆抗体3D11由本实验室制备并保存；H型HBGA唾液样品由本实验室鉴定并保存；其他试剂均为国产分析纯。

1.3兔出血症病毒HP基因的扩增

根据GenBank数据库RHDV中国皖阜株VP60序列(FJ794180，RHDVa型)，利用Primer 5.0软件设计合成一对扩增HP基因的特异性引物，由Invitrogen公司合成，上游引物HP-F：5′-TCGCATATGTCCAGCAAAACTGTTGACTC-3′；下游引物HP-R：5′-GCCAAGCTTTCAGACAT-AAGAAAAGCC-3′。在上游引物的5′端引入NdeⅠ酶切位点，下游引物的5′端引入HindⅢ 酶切位点。以本实验室构建保存的质粒pMD19-T-VP60为模板扩增HP基因。反应体系如下：50倍稀释的模板 1 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，50 mmol·L-1MgSO42 μL，10 mmol·L-1上下游引物各1 μL，10×Pfx Buffer 5 μL，Pfx高保真酶0.4 μL，加ddH2O至总体积50 μL；然后执行下列反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸80 s，30个循环；68 ℃延伸5 min，结束反应。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，胶回收试剂盒纯化后备用。

1.4重组表达载体pET-28a-HP的构建

PCR产物与pET-28a质粒同时进行NdeⅠ和HindⅢ双酶切，T4DNA连接酶16 ℃连接1 h后，转化DH5α感受态细胞，经双酶切鉴定，获得重组表达载体pET-28a-HP，并送Invitrogen公司测序。

1.5HP蛋白的诱导表达

将重组质粒pET-28a-HP转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，挑取单菌落接种到含卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，按1∶100体积比将培养物接种于含卡那霉素抗性的新鲜LB液体培养基中，振荡培养至OD600 nm值为0.6时，加入终浓度为1 mmol·L-1的IPTG，16 ℃诱导表达过夜，12 000 r·min-1离心收集菌体，PBS重悬后冰浴超声破碎，分别收集上清和沉淀，进行12% SDS-PAGE电泳分析。

1.6HP蛋白的纯化及Western blot鉴定

按“1.5”的方法大量诱导表达HP蛋白，经超声破碎后，以含8 mol·L-1尿素的包涵体溶解液溶解沉淀，并用HisTrap亲和柱纯化目的蛋白质，具体操作按亲和层析柱说明书进行。将纯化后的HP蛋白透析去除尿素，所得产物进行还原和非还原SDS-PAGE。采用半干转印法将蛋白质转移至NC膜，以针对VP60 P区的单抗3D11(1∶1 000稀释)为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释)为二抗进行反应，ECL显色观察结果。

1.7HP蛋白与受体HBGAs结合试验

利用已建立的HBGAs结合试验方法(参考诺如病毒与HBGAs结合试验[16]建立)验证HP蛋白与受体HBGAs的结合。具体步骤：将含H型HBGA的唾液样品以PBS(pH7.4)按1∶1 000稀释，包被96孔酶标板，4 ℃过夜后以5%的脱脂乳封闭2 h，PBST洗涤后加入HP蛋白，37 ℃ 孵育1.5 h，同时设VLPs阳性对照(VP60[15])、阴性对照(pET28a空载体诱导蛋白)和空白对照(PBS)。单抗3D11(1∶2 000稀释)和HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释)反应后以TMBS底物显色10～15 min，2 mol·L-1H2SO4终止反应，酶标仪上测定OD450 nm值。

2结果

2.1pET-28a-HP重组表达载体的构建及鉴定

通过PCR扩增获得兔出血症病毒HP基因。经1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，获得大小约为1 053 bp的目的片段(图1)。PCR产物经NdeⅠ和HindⅢ双酶切后定向插入经相同酶切的pET-28a(+)载体中，经双酶切鉴定，获得重组表达载体pET-28a-HP(图2)，测序结果表明其为HP基因，与皖阜株序列相似性为100%。

2.2HP蛋白的表达及纯化

将重组质粒pET-28a-HP转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导表达，超声破碎后，上清和沉淀的SDS-PAGE电泳结果显示，在约37 ku处有一条明显的蛋白质条带，与预期大小一致。表明重组HP蛋白主要以包涵体形式表达，上清中几乎不表达。经HisTrap亲和柱纯化包涵体后，获得较纯净的目的蛋白质(图3)。

2.3HP蛋白的鉴定

纯化的HP蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，与还原HP样品(+β巯基乙醇)相比，非还原HP样品(-β巯基乙醇)在约74 ku处多出一条蛋白质条带(图4的1、2条带)，经Western blot鉴定，结果显示，37和74 ku处的蛋白质均为HP蛋白(图4的3、4条带)，说明纯化后的HP蛋白可形成二聚体结构。2.4HP与HBGAs结合检测

将HP蛋白做一系列梯度稀释后进行HBGAs结合试验。结果显示，随着HP蛋白浓度的增加，HP蛋白与H型HBGAs结合反应的OD450 nm值随之增大，而阴性和空白对照的OD450 nm值均小于0.2，表明HP蛋白能够与H型HBGAs发生结合(图5)。

3讨论

RHDV衣壳蛋白VP60可自聚成VLPs并具有受体结合能力[2]。根据VP60的基因型分析，RHDV可分为RHDV经典型(G1-G5)、RHDVa型(G6)和RHDVb型(RHDV2)，且经典型RHDV与RHDVa的相似性明显高于RHDVb与前两者的相似性[17-19]。中国流行株除国内外首次暴发的毒株WX84外，均为RHDVa型[20]。RHDVa型毒株衣壳蛋白的S区高度保守，P区可进一步分为P1亚区(238—286、450—466、484—579 aa)和P2亚区(287—449、467—483 aa)。P2亚区位于病毒衣壳表面，含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点，其变异程度高于P1亚区[3]。

近年来研究认为HBGAs是RHDV的结合受体，在宿主RHD感染中起重要作用。前期研究发现从感染兔肝提取物中的天然RHDV和重组病毒衣壳蛋白均发现能够特异性地结合HBGAs多糖，并黏附于成年兔的上呼吸道、消化道上皮细胞[8-9]。之后通过核磁共振试验证实了在RHDV与HBGAs结合中，HBGAs上的L-岩藻糖是RHDV-VLPs最小的识别结构[21]。但RHDVa-VLPs上P区所形成的刺突结构是否包含了与受体HBGAs结合的所有要素，以及P区上哪些氨基酸组成了HBGAs的结合域却并不明确。由于同属杯状病毒的诺如病毒(NVs)受体也为HBGAs，因此X.Wang等[3]在通过冷冻电子显微镜和晶体学等方法解析了RHDVa型病毒的结构后，将其与NVs晶体结构尤其是受体结合部位的结构进行了比较，发现RHDVa不具有NVs上与HBGAs相互作用的结合域，两者与HBGAs的结合方式完全不同，并推测病毒表面的腔洞样结构可能与受体结合有关。而在NVs受体研究中，不同基因型的NVs就能够结合不同型的HBGAs受体，该结合与P2亚区的RGD/NGR样结合域有关，但不同型的结合位点并不完全相同[14]，同时研究表明形成颗粒结构的P蛋白比P二聚体及单体具有更强的受体结合能力[22]。在RHDVb型病毒的研究中，M.M.Leuthold等[23]通过X射线晶体学方法发现，HBGAs结合于RHDVb型病毒表面P区所形成的二聚体的交界面处，且P区的几个保守位点与结合密切相关。由于RHDVb所具有的独特的基因型和抗原性，且RHDVb衣壳蛋白基因与经典型RHDV和RHDVa的相似性甚至低于兔杯状病毒(RCV)与后两者之间的相似性，因此也有学者认为RHDVb不属于RHDV的突变株，而是一种新发现的兔病毒[19]。由此推测，RHDVa P蛋白有形成多聚体的可能，且RHDVa和RHDVb与受体HBGAs的结合模式可能不同。为研究RHDVa表面氨基酸与受体HBGAs的结合域，RHDVa病毒衣壳蛋白外表面的P区是最佳对象。

本研究选择皖阜株RHDV(RHDVa型)作为代表研究RHDVa与HBGAs的结合。采用pET28a(+)表达载体和NdeⅠ、HindⅢ插入位点以保证所表达的HP蛋白上除His标签和thrombin裂解位点外，无其他外源氨基酸。经Western blot检测表明，包含铰链区H的P蛋白可以形成二聚体结构。结合试验证实，P区与完整病毒衣壳相似，能与H型HBGA发生结合。这表明RHDVa衣壳蛋白形成的VLPs结构对于HBGAs受体的结合是非必需的，且P区中包含受体结合中必不可少的氨基酸组成和结构特征。但P区二聚体的形成是否增强了P蛋白与受体HBGAs的结合力尚有待进一步研究。以上结果表明所表达的P区的结构特征对于RHDV衣壳蛋白与HBGAs受体的相互作用的研究具有重要意义，原核表达的P区可作为病毒与受体相互作用研究的模型。

4结论

成功构建兔出血症病毒HP基因的表达质粒，并验证HP蛋白的表达，证实包含铰链区H的P蛋白能形成二聚体结构。HBGAs受体结合试验证明HP蛋白与完整VLPs相似，能与唾液中的HBGAs受体发生结合。这表明HP蛋白可替代VLPs作为研究受体结合的模型。

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(编辑白永平)

Expression of the P Dimer of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Capsid Protein and Analysis of Its Binding Ability to Receptor

HU Bo，FAN Zhi-yu，WANG Fang*，WEI Hou-jun，SONG Yan-hua，QIU Ru-long，XU Wei-zhong，XUE Jia-bin

(InstituteofVeterinaryMedicine，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnologyofMinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products，Nanjing210014，China)

Key words:RHDV；capsid protein；P domain；HBGAs；receptor binding

Abstract:Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) is a member of theCaliciviridaefamily (Lagovirusgenus).Similar to human norovirus (Caliciviridae，Norovirusgenus)，RHDV binds histo-blood group antigens (HBGAs) and this is thought to be important for infection.The aim of this study was to determine whether the P domain of RHDV capsid protein (VP60) could form dimers and to analyze its binding ability to HBGAs receptor.The P domain gene containing hinge (HP) was amplified and cloned into pET-28a (+) expression vector and introduced intoEscherichiacoliBL21 (DE3).The recombinant HP protein，confirmed by SDS-PAGE and Western blot，was effectively expressed in form of inclusion bodies by inducing with IPTG.The recombinant protein was then purified with HisTrap affinity chromatography，which could form dimers after purification.The HBGAs binding assay showed that the P domain bound H type HBGA with the same patterns as those of the intact viral capsids.Further structural studies with P domain are needed in order to better understand the HBGA binding mechanisms and virus-receptor interaction.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.015

收稿日期：2015-06-20

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-44)；江苏省农业科技自主创新资金项目[CX (13) 5029]

作者简介：胡波(1982- )，男，江苏南京人，助理研究员，硕士，主要从事畜禽疫病防控与兽医生物技术研究，Tel：025-84390337，E-mail：hadisi2002@163.com *通信作者：王芳，研究员，E-mail：rwangfang@126.com

中图分类号：S858.291；S852.659.6

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0325-06