张俊珍，姬凯元，石占全，刘　彧，胡帅鹏，范瑞文

(山西农业大学动物科技学院，太谷 030801)



lpa-miR-nov-66调控羊驼黑色素细胞CDK5磷酸化作用的研究

张俊珍，姬凯元，石占全，刘彧，胡帅鹏，范瑞文*

(山西农业大学动物科技学院，太谷 030801)

摘要：旨在研究lpa-miR-nov-66在调控羊驼黑色素细胞产生黑色素颗粒过程中对细胞周期依赖性激酶5(CDK5)磷酸化作用的影响。在体外培养的黑色素细胞中转染lpa-miR-nov-66后，采用实时定量PCR、免疫细胞化学、Western blotting、免疫共沉淀等方法检测功能性CDK5作用。结果显示：与阴性对照相比，黑色素细胞被转染lpa-miR-nov-66后，CDK5基因和蛋白表达量均下降，差异极显著(P<0.01)；CDK5激活子是P35，CDK5磷酸化水平及其磷酸化底物——酪氨酸羟化酶(TH)的表达量均被上调，分别呈差异极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05)。结果表明：lpa-miR-nov-66过量表达可通过CDK5的激活子P35上调黑色素细胞CDK5发生磷酸化。该功能性CDK5激酶对底物TH发生磷酸化，是lpa-miR-nov-66调控黑色素生成分子机制的中间环节。

关键词：lpa-miR-nov-66；细胞周期依赖性激酶5(CDK5)；酪氨酸羟化酶(TH)；黑色素细胞

lpa-miR-nov-66是从不同毛色羊驼皮肤的基因表达谱中发现的新的且差异表达的miRNA[1]，其靶基因之一是可溶性鸟氨酸环化酶(Soluble guanylate cyclase，sGC)，lpa-miR-nov-66与sGC的CDS区结合，使sGC在代谢过程中产生cGMP，从而下调黑色素的生成[2]。无论何种物种，sGC的所有信号转导均通过提高cGMP浓度后，cGMP代谢产物G-激酶可对丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化，再通过cGTP调控的磷酸二酯酶调节cAMP水平而实现，继而引起细胞内反应[3]。

CDK家族(CDK1～20)是丝氨酸/苏氨酸激酶，在调控细胞周期过程、转录过程和神经功能中起关键作用[3]。CDK5是细胞周期家族成员之一，但CDK5的作用不同于其他家族成员，对细胞周期不起作用[4]。在前期的研究中发现羊驼皮肤cDNA文库中有CDK5表达[5]，并且CDK5在不同毛色的羊驼皮肤中的表达呈显著差异[6]，在体外培养的黑色素细胞中，CDK5定位于胞质和胞核中[7]，这些均提示，CDK5可能与黑色素细胞存在着相关性。在黑色素生成路径中，cAMP是调控色素形成的关键信使[8]，研究发现，lpa-miR-nov-66在羊驼黑色素细胞中，调控黑色素生成的cAMP路径，引起酪氨酸酶(TYR)及其相关蛋白(TYRP1和TYRP2)的表达下调[2]。CDK5能使体内外的酪氨酸酶(TYR)的羟化酶(TH)发生磷酸化，从而使TYR的活性增强[9]，而TYR是黑色素细胞合成黑色素过程起催化作用的限速酶[10]。在哺乳动物黑色素合成的cAMP路径中，lpa-miR-nov-66是否可通过磷酸化CDK5而影响黑色素颗粒的生成未见报道，本研究主要通过检测lpa-miR-nov-66 对CDK5磷酸化作用的影响，为揭示lpa-miR-nov-66调控黑色素生成的分子机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

所用细胞为本实验室保存的分离培养后传代的第4代羊驼黑色素细胞。pcDNA6.2-lpa-nov-miR66是由Invitrogen公司构建，用于转染羊驼黑色素细胞[2]。

1.2方法

1.2.1羊驼黑色素细胞的处理及分组复苏冻存的羊驼黑色素细胞，待细胞丰度达70%时，弃去细胞中的培养基，加入0.8 mL培养基，将准备好的质粒和转染试剂混和液(500 μL培养基中含3 μg质粒和6 μL Lipfectamine2000)加入细胞培养基中，混匀，置于培养箱中，37 ℃培养36 h后，用正常培养基终止转染。收集细胞，用于RNA和蛋白质提取以及免疫细胞化学。试验组和对照组(Negative control)各设3个生物学重复。

1.2.2细胞总RNA的提取和cDNA合成羊驼黑色素细胞结束转染后，用PBS冲洗3次，按说明书提取总RNA(Invitrogen)，制备cDNA：反应体系：10 μL反应体系中含2 μL 5×Prime ScriptTMBuffer，10.5 μL Prime ScriptTMRT Enzyme Mix，25 pmol Oligo dT 引物，50 pmol随机引物，0.5 μg 总RNA，DEPC水加至10 μL，体系混匀，按37 ℃15 min，85 ℃5 s反应产生cDNA。

1.2.3实时荧光定量PCR按SYRB(TaKaRa)构建好反应体系后(目标基因的引物见表1，退火温度为57 ℃)，反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，57 ℃ 25 s，72 ℃ 10 s，35个循环进行实时荧光定量PCR。内参基因为18S，每个样本设3次重复，获取CT值。用2-△△CT法计算各基因在mRNA水平的相对表达量。

表1定量PCR引物序列

Table 1Quantitative PCR primer sequence

1.2.4免疫细胞化学转染的细胞用4%多聚甲醛在4 ℃固定20 min，在3%的过氧化氢溶液室温反应30 min、5%BSA血清封闭30 min、滴加一抗(兔来源CDK5，1∶75，Boster，Wuhan，China；兔来源anti-phophy-CDK5(Tyr15))，4 ℃放置过夜，滴加二抗(HRP山羊抗兔IgG)，37 ℃孵育1.5 h，加入DAB显色液，显微镜观察并采集图像(OLYPUS，FV1000)。阴性对照组PBS代替一抗。

1.2.5免疫印迹用总蛋白提取试剂盒(Beyotime Biotechnology)提取转染的羊驼黑色素细胞中的总蛋白，测定浓度后，进行SDS-PAGE电泳：每孔上样200 μg总蛋白，在30 V条件下，电泳5 h；将胶上的蛋白质用电转仪转移至PVDF膜，PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1.5 h，并将转印膜放入平皿内，加入anti-phophy-CDK5(Tyr15)多克隆抗体(1∶300)和anti-CDK5多克隆抗体(1∶300)，4 ℃摇床过夜孵育后，用TBST洗膜3次。加入二抗(HRP山羊抗兔IgG)，37 ℃孵育1.5 h，加入ECL发光剂，3 min后甩去工作液，曝光。总蛋白中的目的蛋白和β-actin免疫印迹结果用Image-proplus 6.0软件(Olympus)进行统计和半定量分析印迹条带面积和灰度值。蛋白总量=条带面积×灰度值。

1.2.6免疫共沉淀用总蛋白提取试剂盒(Beyotime biotechnology)提取转染的羊驼黑色素细胞中的总蛋白，测定浓度后，将CDK5一抗(Abcam)加入200 μL 总蛋白中，4 ℃轻摇孵育过夜后，加入20 μL 蛋白G琼脂磁珠，4 ℃轻摇孵育1 h，获得免疫沉淀，该沉淀用500 μL 1×细胞裂解缓冲液洗5次后，悬浮于20 μL 3× SDS缓冲液中，95 ℃加热5 min，14 000 g离心1 min，点样到SDS-PAGE胶(12%～15%)。anti-P35和anti-TH的免疫印迹方法同1.2.5。

1.2.7统计分析实时定量PCR结果以及免疫印迹和免疫共沉淀条带经灰度分析后的结果均用“平均值±标准误(Means±SE)”表示，数据用SPSS16.0软件进行统计分析。

2结果

2.1对黑色素细胞内CDK5在转录水平的表达分析

实时定量PCR结果表明：与阴性对照组相比，转染lpa-miR-nov-66基因的羊驼黑色素细胞中CDK5基因在转录水平下降了0.52倍，试验组与对照组呈差异极显著(P<0.01) (图1)。

2.2对黑色素细胞内CDK5蛋白水平的表达分析

Western blotting结果显示，羊驼黑色素细胞总蛋白中存在能与兔抗CDK5多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带，且符合预期大小(图2A)。对不同试验组羊驼黑色素细胞目的蛋白表达进行定量分析：应用Image-proplus6.0软件对目的基因和内参β-actin的免疫印迹进行半定量分析，试验组与对照组差异极显著(P<0.01) (图2B)。

2.3对羊驼黑色素细胞内CDK5磷酸化的影响

免疫细胞化学结果显示，羊驼黑色素细胞内转染lpa-miR-nov-66后，与对照组相比，胞浆内可见磷酸化CDK5 的免疫阳性信号。与对照组相比，转染lpa-miR-nov-66后的羊驼黑色素细胞内磷酸化CDK5免疫强度增强(图3)。

2.4黑色素细胞内酪氨酸羟化酶和P35的表达

经CDK5富集细胞总蛋白后，将P35和TH做免疫共沉淀，结果发现CDK5磷酸化的激活子是P35，转染lpa-miR-nov-66后，黑色素细胞内P35的表达水平极显著升高(P<0.01)(图4)；而酪氨酸羟化酶(TH)是CDK5的作用底物，且转染黑色素细胞后TH的表达显著升高(P<0.05)(图5)。

3讨论

CDK5在神经发育过程中起重要作用[4，11]。有研究认为，CDK5是神经元特异性的激酶[12]。后来，CDK5被发现在人类癌症发生过程中起重要作用，并陆续发现CDK5在多种细胞中表达，具有调控细胞生长和迁移等新的功能[11]。前期的研究证实CDK5的免疫阳性反应物主要位于羊驼毛球和外根鞘，而且白色羊驼皮肤中CDK5 mRNA 表达丰度低于褐色羊驼皮肤中的表达[6]，证实CDK5与羊驼黑色素细胞中毛色相关基因的表达存在着相关性[5-7]。黑色素细胞是由原始的神经嵴细胞分化形成的，之后进入正在发育的毛囊毛球部[13]，毛球部黑色素细胞产生的黑色素体进入周围毛干的角化细胞中，毛干中黑色素的数量、大小、组成以及分布的不同而产生不同的毛色[14]。

Lpa-miR-nov-66作为一个新的miRNA，在白色羊驼皮肤中的表达量显著高于棕色羊驼皮肤表达量，其靶基因为sGC，通过cAMP路径调控羊驼黑色素生成[2]。sGC的所有信号转导均通过提高cGMP浓度后，cGMP代谢产物G-激酶对丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化，再通过cGTP调控磷酸二酯酶调节cAMP水平而实现的[3]。本研究中检测到lpa-miR-nov-66过表达可使黑色素细胞中CDK5在转录和翻译水平的表达量减少，但磷酸化的CDK5表达量增强，结果说明CDK5磷酸化在lpa-miR-nov-66发挥作用过程中起着至关重要的作用。而磷酸化的CDK5和其他家族成员一样，发挥其功能时需要激活子，本研究发现，CDK5免疫共沉淀中同时检测到P35和P25。P25是P35被calpain剪切后残留下来的羧基端(Carboxy-terminal)部分，比P35可以更长时间地激活CDK5。结果说明P35/P25与CDK5结合，CDK5的激活子是P35。

在黑色素生成路径中，G蛋白偶联受体(GPCR)介导的跨膜信号转导合成黑色素是重要的途径之一。促黑色素细胞激素(α-MSH)与黑色素细胞膜上的褪黑激素受体(MC1R)结合后可激活Gs蛋白，Gs蛋白激活膜内侧的腺苷酸环化酶(AC)，AC的活化使细胞内cAMP水平升高[15]。cAMP激活参与色素沉积的一些细胞内信号途径[16]，活化蛋白激酶A(PKA)导致CREB(cAMP-responsive element-binding)的磷酸化[17]。磷酸化的CREB可激活小眼畸形相关转录因子(MITF)，MITF通过调控黑色素生成相关基因的表达而调节黑色素细胞的分化、增殖和存活[18-19]。在毛色形成的分子通路上，MITF是一个重要的转录调控因子，它通过调控形成黑色素的重要基因而影响黑色素细胞的发育，如TYR及其相关蛋白1和2(TYRP1和TYRP2)[15]。TYR是黑色素细胞中由酪氨酸生成黑色素过程起催化作用的限速酶[8]，具有酪氨酸羟化酶(TH)和多巴氧化酶2种活性，TH催化生成儿茶酚胺多巴路径中的关键步骤，而儿茶酚胺多巴是真黑素合成的底物[20-21]。本研究结果表明，TH是CDK5的作用底物，且在转染lpa-miR-nov-66的黑色素细胞中可检测到TH的表达量发生变化，在前期的研究结果认为lpa-miR-nov-66通过靶基因sGC经cAMP路径调控黑色素的合成，而cAMP可以与蛋白激酶A(PKA)调节亚基相结合，从而允许释放和激活催化亚基，调控下游色素合成分子的表达[15，22]。综上表明，lpa-miR-nov-66在调控羊驼黑色素细胞的黑色素生成路径中，导致黑色素生成变化的直接原因是功能性的CDK5激酶引起TH发生磷酸化。这一结果补充lpa-miR-nov-66调控黑色素生成的分子机理。

4结论

lpa-miR-nov-66过量表达可引起功能性CDK5激酶的表达变化，从而使黑色素内TH的表达发生变化，引起下调黑色素的生成。

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(编辑程金华)

The Effect oflpa-miR-nov-66 onCDK5 Phosphorylation in Alpaca Melanocyte

ZHANG Jun-zhen，JI Kai-yuan，SHI Zhan-quan，LIU Yu，HU Shuai-peng，FAN Rui-wen*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

Key words:lpa-miR-nov-66；CDK5；TH；melanocyte

Abstract:The objective of this research was to investigate the effect oflpa-miR-nov-66 on cyclin dependent kinase 5 (CDK5) and its phosphoration on the pathway of melanogenesis in alpaca melanocytes.Following the transfection of alpaca melanocytes bylpa-miR-nov-66invitro，quantitative real-time PCR，immunocytochemistry，Western blotting and immunopricipitation were mainly used to determine the expression of the functionalCDK5.The results showed that compared to the control，the over expression oflpa-miR-nov-66 in melanocytes resulted in decreased expression ofCDK5 and increased expression of phosphotedCDK5 with significant difference (P<0.01)；P35 was the activator ofCDK5.And it was found thatCDK5-dependent phosphorylation of TH was up-regulated with the higher activity(P<0.05).The results suggested thatlpa-miR-nov-66 gave rise to up-regulation of phos-TH expression on the pathway of melanogenesis by functionalCDK5 binding toP35，which was the intermediate link for the molecular mechanism of regulating melanogenesis.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.011

收稿日期：2015-07-25

基金项目：国家自然科学基金(31201868)；山西省科技攻关项目(20120311024-2)

作者简介：张俊珍(1972-)，男，硕士，副教授，主要从事畜禽生产的研究，Tel：0354-6288980，E-mail：junzhenzhang@163.com *通信作者：范瑞文，E-mail：ruiwenfan@163.com

中图分类号：Q343

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0290-06