熊显荣，兰道亮，2，李　键，2*，字向东，林亚秋，马　力

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041； 2.西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041)



牦牛卵巢小RNA高通量测序及生物信息学分析

熊显荣1，兰道亮1，2，李键1，2*，字向东1，林亚秋1，马力1

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041； 2.西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041)

摘要：本研究旨在利用高通量测序技术描绘牦牛卵巢sRNA图谱，为探析牦牛繁殖性能提供基础。以牦牛卵巢组织作为研究对象，构建牦牛sRNA文库，进行高通量测序和生物信息学分析，最后利用RT-qPCR技术验证miRNA在牦牛卵巢组织中的表达。经测序后得到包含12 126 208 条clean reads，其中特异序列为212 757条；比对分析显示，只有7 383 536 (60.89%) 条总序列及80 981(38.06%) 条特异序列能与牦牛基因组匹配。与黄牛相比，牦牛sRNA中有56个表达量上调，其中miR-135a表达上调最显著；有33个表达下调，其中miR-2316表达下调最显著。RT-qPCR验证6个miRNA在牦牛卵巢组织中的表达情况，定量结果和测序结果基本一致。与牦牛EST序列信息比对后共预测出5个新miRNA。本研究成功绘制牦牛卵巢sRNA图谱，同时证实RNA-Seq高通量测序技术在完善sRNA信息及挖掘新miRNA方面的优势，对研究sRNA在牦牛遗传育种以及以牦牛为重要高原动物模型来进行高原适应性和抗逆性等相关领域的研究具有重要意义。

关键词：牦牛；卵巢；高通量测序；小RNA；生物信息学

牦牛被称作高原之舟，主要分布在中国青藏高原及其毗邻的高山、亚高山地区。在长期的自然选择和人工选择的共同作用下，牦牛对高海拔、低温、低氧牧区具有良好适应性，能充分利用高寒草场资源。牦牛是当地牧民赖以生存和发展的生产、生活资料，也是牧区经济的支柱产业和牧民经济收入的主要来源[1]。但与普通牛种相比，牦牛生长速度慢、性成熟较晚，而且繁殖性能低，成为高原畜牧业发展及生态保护的主要瓶颈之一。近期牦牛基因组的测序工作基本完成[2]，为下一步开展保护牦牛遗传资源、提高牦牛生产性能、研究牦牛生长发育及探析繁殖性能等诸多方面工作提供可靠的依据。

小分子RNA(Small RNA，sRNA)是一类长20～30核苷酸(Nucleotide，nt)的非编码RNA分子。sRNA最初在秀丽线虫中发现，且广泛存在于真核生物中，是重要的转录后调控因子[3-4]。大量研究表明小RNA具有广泛的生物学功能，对个体发育调控、细胞分化、胚胎发育等生物过程起重要作用[5-6]。sRNA主要是通过抑制靶基因翻译或者是直接降解靶基因mRNA达到调控基因表达，由此可知sRNA对大多数的靶基因都是起负调控作用。鉴于sRNA的生物学重要性，准确鉴定其序列及表达时空性是当务之急。然而sRNA序列短、同源性高，因此利用传统的克隆法、基因芯片技术等检测sRNA非常困难。此外，sRNA的数量巨大，相应的工作较复杂、费用高、效率低等；再次假阳性高、灵敏度低、速度慢，难以发现低表达量和低拷贝的新sRNA。随着测序技术的快速发展，高通量测序技术相继诞生并逐渐成熟。高通量测序技术不但能够克服以上难题，而且在发现新的sRNA上具有显著优势。目前高通量测序技术已经成功的应用于拟南芥[7]、水稻[8]、小麦[9]、黑猩猩[10]、人[11]等生物sRNA的研究。

目前有关sRNA生物学作用的研究不断深入，表明其在动植物生长发育、细胞死亡、细胞分化和应答外界胁迫等方面具有重要功能[5，12-14]，并在生物合成和功能研究方面取得了一定的研究进展[15]，但在高原动植物上的相关报道较少。因此，本研究利用新二代的高通量测序技术，对牦牛卵巢sRNA文库进行测序并做了相关的生物信息学分析，以期反映高通量测序技术在加速高原动物sRNA的发现、促进高原动物sRNA的功能研究以及提高人们对动物sRNA进化的认识等优势。此外，为深入研究sRNA在参与调节卵泡生成及排卵过程中所起作用提供基础性工作，对研究sRNA在牦牛遗传育种以及以牦牛为重要高原动物模型来进行高原适应性和抗逆性等相关领域的研究具有重要意义。

1材料与方法

1.1样品采集

从四川红原县屠宰场随机选取5头年龄、个体、体质基本一致的成年(约3周岁)麦洼母牦牛，屠宰后立即采集卵巢，用生理盐水冲洗干净，液氮速冻后，存于-80 ℃备用，用于总 RNA的提取。用同样的方法，在成都青白江屠宰场选取5头健康的成年黄牛(约3周岁)的卵巢，作为对照组。

1.2总RNA提取

参照Invitrogen公司的Trizol法分别提取5头牦牛卵巢组织的总RNA，为保证RNA的纯度，向各RNA样本中加入适量的DNase I (Invitrogen，USA)，37 ℃孵育10 min，然后各取2 μg混合均匀组成一个RNA样品池(Sample pool)。通过Nanodrop ND-1000 (LabTech，USA) 检测RNA的浓度和质量。

1.3小RNA文库的构建及Illumina-Solexa 高通量测序

采用Ambion公司SOLiD Small RNA Expression试剂盒构建牦牛卵巢的sRNA文库。首先，sRNA在连接酶的作用下加5′和3′接头，然后将其反转录成cDNA。向cDNA中加入适量的RNase用于消除未被转录的RNA。为了获得足够的高质量cDNA，进行PCR扩增得到测序文库。构建好的文库用2100 Bioanalyzer (Agilent)和Nanodrop ND-1000进行质量和浓度的检测，然后送深圳华大基因公司测序。

1.4小RNA测序数据处理与分析

测序所得的数据(Raw reads)经除去接头序列、空读序列以及低质量序列(Phred quality < 5)后得到纯净序列(Clean reads)。使用SOAPaligner/SOAP 2.0软件将序列比对到牦牛基因组，统计reads在参考基因组及基因序列上的分布情况及覆盖度，与牦牛基因组至少有3次匹配的reads作为潜在的sRNA及进一步分析。

将sRNA序列与GenBank数据库及Sanger中心的Rfam数据库中的ncRNA (非编码RNA)分别进行比对，识别sRNA序列中的rRNA、tRNA、snRNA等ncRNA；与miRNA数据库(miRBase)中的miRNA进行比对，鉴定样品中的已知miRNA；通过片段互相比对，确定与重复序列相关的siRNA；与外显子、内含子的比对鉴定mRNA降解片段。按照优先级(rRNA等>已知miRNA>重复序列>外显子>内含子)，应用WEGO程序对这些sRNA涉及的主要生物学功能进行GO分类注释。将未获得注释的sRNA作为潜在的新miRNA，利用Mireap和miRanda对这些sRNA进行预测，预测其二级结构、酶切位点以及靶基因等，具体分析流程见图1。通过比对结果统计测序序列的分布情况及频率，同时利用RPKM法计算miRNA的表达量。

1.5小RNA表达的验证

采用RT-qPCR法对高通量测序部分sRNA的表达结果进行验证。利用Ambion mirVanaTMKit试剂盒取提总RNA，RNase-free DNase I去除基因组DNA，然后根据成熟miRNA的序列设计引物，以18S rRNA为内参进行RT-qPCR。采用Stratagene公司的High-Specificity miRNA RT-qPCR Detection Kit试剂盒及CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，USA)。所有定量PCR反应均重复3次，65～95 ℃每隔0.5 ℃读板1次，绘制熔解曲线。检测结果采用表达量差异△△Ct法对目的sRNA表达水平进行相对定量分析。

1.6miRNA靶位点的预测及其功能分类

通过miRNA序列与牦牛已公布EST的比对，预测潜在的miRNA靶位点，具体方法参照文献[16-17]。预测遵循miRNA与靶基因错配不超过4个碱基、相邻碱基不错配等原则。然后将预测的所有靶基因进行GO注释分析，预测其可能参与的生物学过程和功能，进行相应分类及统计。

1.7统计与分析

所有组别的试验至少重复3次，SPSS13.0进行ONEWAY ANOVA检验，用SSR法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2结果

2.1牦牛小RNA

为了获得牦牛小RNA，构建了牦牛卵巢sRNA文库，并用高通量测序技术进行测序。去除接头并滤去低质量数据后，获得长度分布在16～30 nt的大量牦牛sRNA序列，其中以22 nt的序列居多，是由Dicer酶途径产生的sRNA的典型长度，具有一定的保守性(图2)。去掉小于18 nt的序列后，最

终获得12 126 208条纯净序列(表1)，其中特异序列的数目为 212 757 条。经SOAP 软件将这些sRNA与牦牛、黄牛基因组比对后，其中只有7 383 536 (60.89%)的总序列及80 981(38.06%) 的特异序列能匹配牦牛基因组。将牦牛sRNA与GenBank、Rfam、miRBase进行多重比对，最后依次注释(图3，表2)。由于牦牛全基因组序列的不够完全，约69%的sRNA序列未能注释。所注释的sRNA中，rRNA最多，占总数的13.4%，其次是外显子正义(5.8%)、内含子正义(3.23%)、tRNA (3.27%)，其余都只占很少一部分。

2.2miRNA的分析

为了寻找牦牛卵巢中的已知miRNA，将牦牛sRNA与miRBase中的miRNA进行比对发现，总共有9 161 081条能匹配，其中5 035条特异序列与牦牛miRNA有同源性(表2)。表达丰度差异分析后发现，在牦牛sRNA中有56个miRNA表达量比黄牛显著上调，有33个miRNA表达显著下调(图4)。其中miR-135a表达上调极显著(P<0.01)，miR-2316表达下调极显著(P<0.01)。

表1黄牛与牦牛小RNA测序数据处理及片段长度分布统计

Table 1Summary of data cleaning and distribution of tags produced by yak and cattle small RNA sequencing

表2牦牛sRNA注释结果

Table 2Annotation of yak small RNAs

2.3新miRNA的预测与分析

miRNA初始转录位点多位于基因间隔区、内含子以及编码序列的反向重复序列上，其前体具有标志性的发夹结构，成熟体的形成是由Dicer酶的剪切实现的。利用这一显著特征通过Mireap软件来预测新的miRNA。初步预测结果显示，共发现27条候选miRNA，并且这些候选miRNA首位碱基具有一定的偏向性(图5)。利用牦牛EST序列信息进行牦牛新miRNA预测，共预测出5个miRNA (依次命名为new miRNA1、new miRNA2、new miRNA3、new miRNA4和new miRNA5)，但其表达量都较低(表3)。

2.4已知miRNA的表达模式

为了进一步验证高通量测序所获得的结果，随机选择6个表达量较高的miRNA，利用RT-qPCR检测其在牦牛卵巢中的表达情况。结果显示与高通量测序结果基本吻合(图6)，由此表明本次高通量测序结果准确性较高，可信度大。

2.5miRNA的潜在靶位点及功能分类

为了进一步深入研究miRNA在牦牛卵巢中的生物学功能，通过与已公布的牦牛EST序列比对，预测潜在的miRNA靶位点。结果显示，已知的保守miRNA共预测出1 403个潜在靶基因，3 501个靶位点。如图7所示，这些潜在靶基因涉及较广的生物学过程及功能，涉及生物学过程(Biological processes)、细胞组分(Cellular components)及分子功能(Molecular functions)3大类共47个小类。由于牦牛EST数据的有限，未能对预测出的5个新miRNA进行潜在靶位点分析。

表3利用牦牛EST 序列预测的新 miRNA

Table 3The novel miRNAs prediction with yak EST sequences

3讨论

3.1牦牛卵巢sRNA轮廓及特点

牦牛是青藏高原地区及周边群众赖以生存的重要生产生活资料之一。但其性成熟较晚，且普遍繁殖性能低下，成为长期制约牦牛产业发展的重要问题。sRNA介导的转录后基因调控是动植物的一种新型基因调控机制，它在个体发育调控、细胞分化、胚胎发育等生物过程中起着举足轻重的作用。本研究将5头牦牛的卵巢样本RNA等量混匀，组成了一个牦牛卵巢样本池，通过高通量测序技术后一共获得12 126 208条纯净序列，其中有212 757条特异序列，由此表明文库构建成功且测序质量良好。这些sRNA长度主要集中在20～23 nt，与M.M.Hossain等[18]研究结果基本一致。与牦牛基因组比对后发现共有60.89%的总序列及38.06%的特异序列能匹配。经功能注释后发现miRNA(75.55%)占总序列数的大部分，但却只占特异序列数的2.37%，由此表明miRNA在牦牛卵巢组织中有较复杂的调控机制。此外未注释的sRNA有21.12%的总序列及68.92%的特异序列，可能是由于牦牛基因组的不够完善。当然，随着牦牛基因组序列信息的不断补充，可以进一步利用其基因组信息进行牦牛sRNA的相关研究，这样获得的结果将会更加丰富和完善。

3.2sRNA与卵巢的功能

卵巢的滤泡发生和早期胚胎发育需要大量基因表达的协调和信息交流。这些基因的表达需要时空上的精准性，任何的表达改变均会导致卵母细胞和早期胚胎的发育异常。然而sRNA介导的调控通路可能是卵巢基因表达精准性的保障。目前研究表明，在哺乳动物卵巢组织中sRNA广泛存在。S.Ro等[19]在成熟的老鼠卵巢中鉴定出122条成熟的miRNA，认为这些sRNA在卵巢的发育以及卵母细胞的成熟过程中起关键作用。此外，T.Mishima等[20]也在成年老鼠的卵巢中获得已知miRNA，且一条新的miRNA，推测这些sRNA与小鼠的繁殖机能存在密切联系。M.M.Hossain等[18]在牛的卵巢中发现了74条miRNA，其中有24条是新发现的miRNA。S.K.Tripurani等[21]在新生牛胎儿的卵巢中发现58条miRNA，其中有16条是首次发现。随着测序技术以及计算机处理技术的快速发展，sRNA在生殖领域的的研究也做得更广泛更深入。H.W.Ahn等[22]利用Illumina Genome Analyzer在老鼠新生胎儿的卵巢中对miRNA进行研究，结果发现516条miRNA，其中有118条miRNA是首次发现的。此外，C.J.Creighton等[23]利用Illumina GenomeAnalyzer深度测序技术，从正常和疾病女性生殖器官得到的103个组织或者细胞系建立sRNA文库，发现了404个已知的miRNA和132个新miRNA。由此推测，sRNA在卵巢中有着及其重要的作用。

卵泡的生长与排卵过程的顺利进行与sRNA存在密切的联系。F.Tang等[24]研究表明，miR 30、miR 16、let 7和miR l792家簇在卵子发生和早期胚胎发育过程中的表达模式是动态变化的。let 7家族的miRNA在多种细胞活动包括细胞周期调控都有重要功能，随着卵泡的生长其表达量逐渐增加。张晓东等发现let 7家族的多个成员在山羊卵巢中均有较高表达[25]。本研究中，let 7a、let 7b、let 7c、let 7f、let 7g和let 7e在牦牛卵巢中均有较高表达，其中let 7a表达量在所有sRNA中最高(187 666)。经靶基因预测和KEGG通路分析表明，let 7家族可能与Wnt、TGF-β等信号通路有关，从而影响卵泡发育、排卵和激素释放等生殖活动[26]。目前已经证实sRNA与原始卵泡在卵巢内生长发育到成熟排卵也存在一定的联系。D.Tesfaye等[27]发现在牛卵母细胞成熟过程中，有31个sRNA表达下调，28个表达上调；其中miR-125、miR-127等的上调表达对卵泡发育具有重要作用。近年来，研究报道sRNA与卵巢病变有关，且miRNA已成为卵巢病理诊断的重要手段。M.V.Iorio等[28]通过比较分析卵巢的肿瘤组织和正常组织发现，miRNA在卵巢上皮组织中表达差异显著，其中，卵巢癌组织中过表达的miRNA有miR-200a、miR-141、miR-200c等，而miR-199、miR-140等明显下调。此外，在转录前这些下调的miRNA的基因组拷贝数明显低于正常值。经预测发现，这些miRNA家簇的靶基因主要调节细胞周期和免疫反应。这就意味着这些miRNA家簇的下调导致卵巢肿瘤的生长加速[29]。卵巢上皮细胞的异常增殖可能是卵巢癌发病的早期征兆。卵巢癌组织中miRNA-210和miRNA-214显著下调，可能引起HIF和Akt信号通路的激活而促进肿瘤的生长[30]。功能早衰的卵巢组织中，miR-202、miR-146a、miR-125b-2、miR-139-3p、miR-654-5p等都过表达，而let-7c和miR-144表达却低于正常组织[28]。本研究中，所采集的卵巢组织均来自成年的空怀期健康牦牛，未发现卵巢异常。然而有关sRNA在卵巢发育、卵泡生长、早期胚胎发育及卵巢病变中的功能研究还十分有限，有待进一步深入研究。

3.3牦牛sRNA的验证及新miRNA的发现

牦牛卵巢中的sRNA与牛、人等的已知miRNA具有高度同源性，相似度在90%以上，表明牦牛的miRNA调控方式可能与其他动物有一定的相似性。其中有些miRNA家族表达量特别高，如let-7，miR140，miR199及miR320等，它们可能在牦牛卵巢中起重要调控作用。为了进一步验证这些miRNA在牦牛卵巢中的表达，用RT-qPCR的方法对测序丰度较高的6个miRNA进行验证，与测序结果基本一致，说明这些miRNA确实存在于牦牛卵巢中且表达量较高。测序结果发现miR-135a和miR-2316变化极显著。H.W.Ahn等[22]报道miR-135a在新生小鼠卵巢中也大量表达，推测其在性腺的分化及发育过程中起重要作用。M.M.Hossain等[18]也在成年牛的卵巢中获得miR-2316，推测miR-2316与牛的繁殖机能存在密切联系，促使卵子细胞的分裂、胚胎的发育以及调节相关基因的转录。

尽管牦牛基因组序列不够完善，本研究利用数据库中的EST信息预测出5个新miRNA。当然这5个新预测的miRNA有待进一步验证。大部分动物的miRNA靶位点分布在编码区的某个互补位置，偶尔在5′端的非编码区[31]。本研究所预测的新miRNA的注释功能是参与细胞代谢以及一些生理加工过程，这一结果与之前的研究结果一致[32]，但与植物方面相关报道存在较大差异[33]。由于牦牛的全基因组以及其EST序列信息有限，确定新miRNA的潜在靶位点以及其功能存在较大的困难。

4结论

本研究应用高通量测序技术对牦牛卵巢进行了sRNA测序分析，研究其sRNA的表达谱。表达差异分析发现，在牦牛sRNA中有56个miRNA表达量比黄牛显著上调，有33个miRNA表达显著下调。与牦牛EST序列信息共预测出5个新miRNA。这些miRNA在牦牛中到底起到何作用，是否在决定牦牛高原适应性及繁殖性能中起调控作用，还需要进一步的验证。

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(编辑程金华)

Solexa Sequencing of Small RNAs in Yak (Bosgrunniens) Ovaries and Bioinformatics Analysis

XIONG Xian-rong1，LAN Dao-liang1，2，LI Jian1，2*，ZI Xiang-dong1，LIN Ya-qiu1，MA Li1

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China；2.InstituteofQinghai-TibetanPlateauResearch，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

Key words:yak；ovary；Solexa sequencing；small RNA；bioinformatics

Abstract:The small RNA transcriptome profile of yak ovary was described by Solexa deep sequencing，and provided the basic data for future study on yak breeding performance.In this study，yak ovaries were used for building small RNAs library，and then Solexa sequencing and bioinformatics were applied to analysis.Meanwhile，the expression of selected miRNAs was validated by RT-qPCR.After Solexa sequencing，a total of 12 126 208 clean reads were obtained from the ovary library，which contained 212 757 distinct sequences.Alignment analysis showed that 7 383 536 (60.89%) of total sequences and 80 981 (38.06%) distinct sequences were mapped to the yak reference genome.The results of differential expression analysis showed that 56 small RNAs were up-regulated and 33 small RNAs were down-regulated in yak ovary compared to the cattle counterparts.Among these RNA，miR-135a and miR-2316 had the largest fold-change.The expression of 6 selected miRNAs in yak ovary tissues obtained by RT-qPCR was consistent with the Solexa sequencing results.Furthermore，5 novel small RNAs were predicted after compared to the yak EST sequence information.All above suggested the small RNAs transcriptome profile of yak ovary was successfully described，and our results confirmed that Solexa sequencing technology has a great advantage in facilitating small RNA information and mining new miRNAs，and provide valuable small RNA data for further facilitate the yak genetic breeding and study the adaptation and resistance to high altitude and other related fields of highland animal.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.008

收稿日期：2015-04-21

基金项目：四川省科技支撑计划(2014NZ0114);西南民族大学牦牛创新团队(13CXTD01)

作者简介：熊显荣(1984-)，男，江西赣州人，硕士，主要从事牦牛细胞生物学和发育生物学研究，E-mail: xianrongxiong@163.com *通信作者：李键，教授，主要从事牦牛细胞生物学和发育生物学研究，E-mail: jianli_1967@163.com

中图分类号：S823.8+5.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0055-09