林仁敬，谭 蕊

白术七物颗粒对气阴两虚型结肠慢传输型便秘大鼠结肠组织血管活性肠肽及P物质的影响

林仁敬，谭 蕊

【摘要】目的研究白术七物颗粒对气阴两虚型结肠慢传输型便秘(STC)大鼠结肠组织血管活性肠肽(VIP)及P物质(SP)的影响，初步探讨白术七物颗粒对气阴两虚型STC的治疗作用及其作用机制。方法2014年10—12月，采用随机数字表法将60只SD大鼠分为正常组、模型组、治疗组，各20只。模型组、治疗组予以皮下注射盐酸吗啡注射液，同时灌服青皮、枳壳、附子配方颗粒，建立气阴两虚型STC模型；正常组皮下注射等量等渗0.9%氯化钠注射液。记录造模期间大鼠的一般状况，造模前、后24 h各组大鼠粪便干重，肠道炭末推进率。造模成功后，治疗组大鼠灌服白术七物颗粒水溶液，其余两组灌服等量等渗0.9%氯化钠溶液。给药14 d后检测各组大鼠结肠组织VIP、SP水平。结果正常组大鼠运动灵活，饮食、饮水、大小便正常；其余两组大鼠造模后出现懒动、毛色枯黄、大便次数减少、颗粒变大且质硬等情况。造模前3组大鼠粪便干重比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模后模型组、治疗组大鼠粪便干重低于正常组(P<0.05)。模型组、治疗组大鼠肠道炭末推进率小于正常组(P<0.05)。模型组、治疗组大鼠VIP水平高于正常组(P<0.05)；治疗组大鼠VIP水平低于模型组(P<0.05)。模型组、治疗组大鼠SP水平低于正常组(P<0.05)；治疗组SP水平高于模型组(P<0.05)。结论白术七物颗粒能有效治疗气阴两虚型STC，其作用可能与下调VIP水平、升高SP水平有关。

结肠慢传输型便秘(slow transit constipation，STC)是一类主要以胃肠动力明显减弱为特点的顽固性便秘，迄今为止，其病因仍不完全明确[1]。临床上常以大便次数减少、无便意、排便困难、排便不尽感为主要表现，症状顽固，治疗困难[2]。目前，其发病率有逐年上升的趋势，且有年轻化趋向[3]。本研究主要通过观察白术七物颗粒对气阴两虚型STC大鼠结肠组织血管活性肠肽(VIP)、P物质(SP)水平的影响，初步探讨白术七物颗粒对气阴两虚型STC的治疗作用及其作用机制，为临床应用白术七物颗粒治疗气阴两虚型STC提供有力的实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物2014年10—12月选取无特定病原体(SPF)级SD大鼠60只，清洁级，雌雄各30只，体质量200～220 g，均为湖南中医药大学动物实验中心于湖南斯莱克景达实验动物有限公司代为购买，动物来源证号为：NO.43004700009363。于湖南中医药大学动物实验中心SPF级实验室内饲养，室内自然光照明，温度(22±3)℃，相对湿度40%～70%。采用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、治疗组，各20只，各组大鼠每天自由适量饮水摄食。

1.2主要试剂及药物白术七物颗粒剂(专利号：201210057943.9)：购买于湖南中医药大学第二附属医院药剂科，每次用开水冲泡搅匀，制成含生药24 g/kg的水溶液；青皮、枳壳、附子配方颗粒：购买于湖南中医药大学第二附属医院药剂科，每次用开水冲泡搅匀，制成含生药13 g/kg的水溶液；盐酸吗啡注射液：沈阳第一制药厂生产，10 mg/支，购买于湖南中医药大学第二附属医院药剂科；0.9%氯化钠注射液：湖南金健药业有限责任公司生产，购买于湖南中医药大学第二附属医院药剂科；炭末混悬液：购买于长沙来弗曼生物科技有限公司；VIP、SP抗体：美国Abcam生产(VIP批号201311，SP批号201310)，购买于长沙来弗曼生物科技有限公司。

本研究创新点：

本研究探讨中药复方制剂白术七物颗粒多环节治疗气阴两虚型结肠慢传输便秘(STC)的作用机制，初步论证了白术七物颗粒具有多药理机制协同治疗气阴两虚型STC的假说，其机制可能与下调血管活性肠肽(VIP)水平、提升P物质(SP)水平有关，为中药复方治疗气阴两虚型STC的研究提供了一种新的模式或方向。

1.3实验仪器电子精密天平(上海光学仪器厂)，眼科手术器械(湖南中医药大学第二附属医院提供)。

1.4实验方法

1.4.1模型制备造模前将60只大鼠置于实验笼内3 d，使其适应环境。模型组、治疗组参照文献[4]的方法予以皮下注射盐酸吗啡注射液2.5 mg·kg-1·d-1，并参照文献[5]中的方法同时灌服青皮、枳壳、附子配方颗粒(包括青皮18 g、枳壳18 g、附子15 g)13 g/kg；正常组皮下注射等量等渗0.9%氯化钠注射液。连续45 d，1次/d。观察造模期间大鼠的一般状况，并予以电子精密天平称取造模前、后24 h各组大鼠粪便干重。末次造模给药24 h后，各组随机抽取5只大鼠分别经口灌入炭末混悬液1 ml/100 g，30 min后处死，运用眼科手术器械立即解剖大鼠，截取直肠末端至幽门之间肠管，测量肠道全长及炭末推进距离，再计算其占肠道全长百分比，即肠道炭末推进率。

1.4.2给药方法造模成功后，治疗组大鼠按照体表面积[6]换算成成人等效剂量，即灌服含生药量24 g·kg-1·d-1的白术七物颗粒水溶液；其余两组灌服等量等渗0.9%氯化钠溶液，连续14 d。实验期间，每隔2 d称重1次，并根据体质量变化情况调整给药剂量，并给予所有大鼠自由饮水、摄食，每3～5 d清洗实验笼。

1.5观察指标给药14 d后处死大鼠，切取部分结肠，纵向剪开，用0.9%氯化钠溶液清洗并去除内容物，经液氮研磨制成质量体积比为1∶10的匀浆，2 500 r/min低温离心20 min(离心半径13.5 cm)，留取上清液，-70 ℃保存待测。用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测VIP、SP水平。

2结果

2.1模型的评价

2.1.1一般状况正常组大鼠运动灵活，饮食、饮水正常，大小便正常。其余两组大鼠造模后出现懒动、毛色枯黄、抵抗微弱、舌质淡略胖大、少津、无苔、尾巴暗、大便次数减少、颗粒变大且质硬等情况，解剖见粪便集中在结肠段，呈串珠状或球状，质干硬。

2.1.2粪便干重比较造模前3组大鼠粪便干重比较，差异无统计学意义(P>0.05)；造模后3组大鼠粪便干重比较，差异有统计学意义(P<0.05)。造模后模型组、治疗组粪便干重低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table 1Comparison of the number of rats having dry weight feces among the three groups

组别只数造模前造模后24h正常组205.55±0.225.51±0.24模型组205.54±0.234.06±0.33a治疗组205.45±0.283.88±0.49aF值1.05118.58P值0.331<0.001

注：与正常组比较，aP<0.05

2.1.3肠道炭末推进率比较正常组大鼠肠道炭末推进率为(77.19±8.00)%，模型组为(31.93±3.30)%，治疗组为(30.53±1.25)%。3组大鼠肠道炭末推进率比较，差异有统计学意义(F=378.46，P<0.05)；模型组、治疗组大鼠肠道炭末推进率小于正常组，差异有统计学意义(q=32.95、33.97，P<0.05)。

根据对各组大鼠的一般状况、粪便干重、肠道炭末推进率的比较，证明气阴两虚型STC大鼠模型制备成功。

2.2VIP、SP水平比较3组大鼠VIP水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组大鼠VIP水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组大鼠VIP水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。3组大鼠SP水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组大鼠SP水平低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组SP水平高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table 2Comparison of the VIP and SP expression levels in colon tissue of rats among the three groups

组别只数VIPSP正常组1588.20±14.21144.29±13.97模型组15120.93±16.29a98.00±19.79a治疗组15100.45±17.09ab116.62±16.36abF值16.2134.71P值<0.001<0.001

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；VIP=血管活性肠肽，SP=P物质

3讨论

STC是因结肠传输功能减弱致使肠内容物滞留于结肠而引起的顽固性便秘。目前临床上通常将功能性便秘分为3类：慢传输型便秘、出口梗阻型便秘、混合型便秘[7]。STC占便秘的16%～40%，约占功能性便秘的45.5%，是临床上比较常见的一种类型[8]。长期慢性便秘不仅会给患者带来许多苦恼，并且还在结肠癌、肝性脑病、乳腺疾病、早老性阿尔茨海默病等的发病中起着推波助澜的作用[9]。便秘甚至可以因诱发急性心肌梗死或脑血管意外而直接危及患者生命[10]。现代医学采用内科治STC疗效果常不甚满意，手术治疗有严格的手术适应证且以后仍有一定的便秘复发率，并可能出现腹泻等并发症[11]。与西医、西药相比，中医药治疗STC 不但在通便方面有优势，同时，对紊乱的胃肠功能也进行了调整，使患者的体质情况得到改善，提高了患者的生活质量，在治疗便秘方面有广阔的发展前景[2]。本研究通过建立气阴两虚型STC大鼠模型，造模成功后治疗组予以白术七物颗粒水溶液灌胃治疗，通过ELISA法检测各组STC大鼠结肠组织VIP、SP水平，旨在初步探讨白术七物颗粒对气阴两虚型STC的治疗作用及其作用机制。

VIP属肽能神经递质，是肠神经系统中一种主要的抑制性神经递质，能够松弛胃肠道平滑肌，增强胃肠黏膜腺体分泌，抑制胃肠蠕动。若其水平增高，则可减少胃肠黏膜的分泌活动，抑制胃肠平滑肌收缩，从而抑制肠蠕动而最终导致慢性便秘[12]。SP能神经元存在于消化道管壁各层组织中，能够促进胃肠道肌肉收缩，属于速激肽能神经元。近年来有研究表明，STC患者结肠肌间神经丛SP水平明显降低，SP神经病理改变和功能障碍与结肠传输功能障碍密切相关[13]。白术七物颗粒是由沉香四磨汤加生白术、生地黄化裁而来，方中重用生白术益气健脾，为君药；生地黄为臣药，生津养血、滋阴清热；木香善行胃肠之气，且能助白术使脾气得运；槟榔尤擅行胃肠之气，消积导滞，兼能缓泻通便，为臣药；沉香擅降气温中；乌药擅行气温中；佐以升麻，升举阳气，诸药合用，益气养阴，行气运下，便秘自除[14]。

本研究结果显示，模型组、治疗组大鼠VIP水平高于正常组，治疗组大鼠VIP水平低于模型组，提示白术七物颗粒灌胃治疗能降低结肠组织中VIP水平。VIP是肠神经系统中具代表性和研究较深入的神经肽，也是重要的肽类神经递质之一，许多研究已证明，VIP在胃肠运动调节中主要起抑制效应[15]。因此，上述结果的可能机制是，白术七物颗粒通过降低VIP对胃肠道的抑制作用促进胃肠运动。以往实验研究证明，SP是胃肠运动调节中主要的兴奋性神经递质，对胃肠道的兴奋作用表现为对胃肠纵行肌和环行肌有双重的收缩效应，包括直接的短时作用和紧随的由胆碱能神经释放乙酰胆碱起的长时作用[16]。本研究结果显示，模型组、治疗组大鼠SP水平低于正常组，治疗组SP水平高于模型组，提示白术七物颗粒能增加结肠组织中SP水平，其可能通过肠道局部SP来提高肠壁内神经元的兴奋性，促进肠运动，进而达到有效治疗STC的目的。

本研究仍存在不足之处，并未对白术七物颗粒降低VIP水平、升高SP水平的具体机制做进一步深入研究。

综上所述，白术七物颗粒具有治疗气阴两虚型STC的作用，其可通过下调结肠组织内VIP水平、升高SP水平而达到治疗作用，这为临床使用白术七物颗粒治疗气阴两虚型STC提供了有力的实验依据。

作者贡献：林仁敬进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；谭蕊进行实验实施、评估、资料收集；林仁敬进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔丽红)

【关键词】便秘；白术七物颗粒；气阴两虚；血管活性肠肽；P物质

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Effect of Baizhu Qiwu Granules on VIP and SP of Colon Tissue of Rats With Colonic Slow Transit Constipation of Qi and Yin Deficiency TypeLINRen-jing,TANRui.DepartmentofAnorectal,theSecondAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedieine,Changsha410005,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the influence of Baizhu Qiwu granules on vasoactive intestinal peptide (VIP) and substance P (SP) of colon tissue of rats with colonic slow transit constipation (STC) of qi and yin deficiency,and to preliminarily investigate the efficacy and mechanism of Baizhu Qiwu granules in the treatment of STC of qi and yin deficiency.MethodsFrom October to December in 2014,60 SD rats were divided into normal group (n=20),model group (n=20) and treatment group (n=20) by random number table method.Model group and treatment group were administrated with morphine hydrochloride injection by subcutaneous injection and were also administrated with formula granules composed of pericarpium citri reticulatae viride,fructus aurantii and aconitum carmichaelii to build STC models of qi and yin deficiency;normal group was administrated with the same amount of 0.9% sodium chloride injection by isotonic subcutaneous injection.The general condition of the rats was recorded;before model building and 24 hours after model building,the condition of dry weight faeces and the rate of charcoal propulsion in intestinal tract were observed.After successful model building,the treatment group was administrated with water solution of Baizhu Qiwu granules by drench.The other two groups were administrated with the same amount of 0.9% sodium chloride injection by isotonic subcutaneous injection.The VIP and SP levels in colon tissues of the rats were detected 14 days after drug administration.ResultsThe rats of the normal group had flexible motion and normal diet,drinking and defecation;the rats of the other two groups behaved sluggish in moving,with their hair dry and yellow,the amount of stool decreasing and the stool particle being smaller and harder.Before model building,the three groups were not significantly different in the number of rats having dry weight feces (P>0.05).After model building,the model group and the treatment group were lower than normal group in the number of rats having dry weight feces (P<0.05).The model group and treatment group were lower than normal group in the rate of charcoal propulsion in intestinal tract (P<0.05).The model group and treatment group were higher than normal group in VIP level (P<0.05);the treatment group was lower than the model group in VIP level (P<0.05).The model group and treatment group were lower than normal group in SP level (P<0.05);the treatment group was higher than model group in SP level (P<0.05).ConclusionBaizhu Qiwu granules are effective in the treatment of STC of qi and yin deficiency,and the mechanism may be related with the reduction of VIP level and the increase of SP level.

【Key words】Constipation;Baizhu Qiwu granule;Qi-yin deficiency;Vasoactive intestinal peptide;Substance P

(收稿日期：2015-05-09；修回日期：2015-10-14)

【中图分类号】R 256.35

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.020

通信作者：谭蕊，410007 湖南省长沙市，湖南中医药大学第二临床学院；E-mail：758577856@qq.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81302977)；湖南省教育厅重点学科中医外科学资助项目(湘教发[2011]76号)
作者单位：410005 湖南省长沙市，湖南中医药大学第二附属医院肛肠科(林仁敬)；湖南中医药大学第二临床学院(谭蕊)

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