贾静

（福建医科大学附属泉州第一医院，福建 泉州362000）

✿综述及其他✿

乳腺癌播散肿瘤细胞检测进展

贾静

（福建医科大学附属泉州第一医院，福建 泉州362000）

本文通过文献回顾的方式对关于乳腺癌播散肿瘤细胞检测的方法及其进展进行了总结。免疫组化的方法因其特异性高而成为目前乳腺癌播散肿瘤细胞检测中的金标准，但由于其灵敏度稍低，而且由于各检测单位缺乏统一、标准的检测流程，故其临床的应用受到一定的限制。今后若能在大样本量、随机前瞻性研究的支持下，统一目前乳腺癌播散肿瘤细胞检测中的分歧，必将对乳腺癌的诊疗起到极大的促进作用。

乳腺癌；播散肿瘤细胞；检测

1 乳腺癌播散肿瘤细胞检测的意义

乳腺癌是目前多见的女性恶性肿瘤之一。虽然其治疗方法有了很大进步，但总体生存率并没有明显改善，有研究发现，有50%非进展期乳腺癌以及30%淋巴结阴性的乳腺癌患者在手术后5年内出现远处转移，显然，目前的乳腺癌TNM分期并不能准确预测患者对治疗的反应以及预后等情况。目前，针对乳腺癌播散肿瘤细胞的检测是乳腺癌诊疗中的热点问题，Braun等[1]对4703例可手术的乳腺癌患者进行了5年的随访，结果证实，检出播散肿瘤细胞是预测疾病早期复发和死亡的独立指标。

2 可用于检测的标本

目前针对乳腺癌播散肿瘤细胞的检测主要是根据待检组织和乳腺癌细胞的组织来源不同来进行鉴别。对于乳腺癌患者而言，一旦在以下组织中检测出上皮来源的细胞，即被认为是乳腺癌细胞播散所致。

2．1 淋巴结

腋窝淋巴结以及内乳淋巴结一直都是判断乳腺癌预后好坏的重要因素。淋巴结连续切片被认为是检测乳腺癌有无局部侵犯的金标准。

2．2 外周血

2．3 骨 髓

乳腺癌主要通过淋巴系统和血循环系统进行播散，而骨骼是乳腺癌经血液播散后的常见定植器官。骨髓中检出播散肿瘤细胞和乳腺癌患者的TNM分期以及疾病的复发、疾病相关死亡率之间都存在一定的相关性。

3 待检标本的富集技术

相比于待检标本中的正常细胞，播散肿瘤细胞所占的比例很小，因此，有必要对待检标本进行富集、纯化，以提高检出率。目前常用的富集技术主要包括：

3．1 离心法

即利用离心机分离待检标本中的单个核细胞，常用的方法包括Ficoll法以及OncoQuick法等。

3．2 免疫磁化富集技术

使用连有微小磁珠的特殊抗体筛选目的细胞。经磁化富集之后的标本可进一步利用免疫学技术或分子生物学技术检测其中的播散肿瘤细胞。

④廊道。廊道的震损检查信息包括裂缝、剥落、排水孔、渗水、渗流量等。其中，裂缝信息包括裂缝的位置、长度、深度以及宽度等，剥落信息包括剥落位置和程度，排水孔信息包括位置和现象，渗水信息包括位置和程度等。

4 检测乳腺癌播散肿瘤细胞的方法及其原理

4．1 细胞学水平

针对细胞水平的研究可以粗略的分为2大类：利用单克隆抗体＋形态学检查和仅仅利用单克隆抗体检测播散肿瘤细胞的方法。

4．1．1 基本原理 基于乳腺癌是来源于上皮组织的恶性肿瘤，而发源自内胚层的造血组织在正常情况下是不能检出上皮细胞，故一旦检出，则认为所检出的上皮细胞就是源自恶性组织播散。

4．1．2 检测方法 （1）免疫组织化学技术／免疫细胞技术（IHC/ICC）：其原理主要是应用单克隆抗体与相应特异性的肿瘤标志物结合，在组织细胞原位对相应抗原进行定性、定位和定量的测量，该方法将免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来，在细胞水平、亚细胞水平检测各种抗原物质，包括蛋白质、

多肽、酶、癌基因和抑癌基因的产物、激素以及受体等。免疫组织化学技术可以同时集合免疫反应的高度敏感性和细胞形态学的高度特异性，一方面提高检测的敏感度，同时，免疫组化技术还可以对分离出来的异常细胞进行形态学的观察，进一步确定此类细胞是否真的来源于恶性组织，从而在一定程度上降低了假阳性的发生率。免疫组化技术是目前检测播散肿瘤细胞的金标准，其检测的敏感度可以达到1个上皮细胞/105-6个外周血单个核细胞。

（2）流氏细胞技术（flow cytometry）：利用单克隆抗体分离目的细胞，检测速率较快，检出率可疑达到1个阳性细胞/107血细胞。由于仅能检测待检标本中的细胞表面的特定表达产物，而不能对被检出细胞进行形态学的观察，因此存在一定的假阳性。

4．2 基因水平

4．2．1 基本原理 肿瘤细胞的基因结构（DNA）及其表达（mRNA）是不同于正常细胞的，转移的恶性肿瘤细胞仍然表达具有起源组织特征的特异性标记。我们可以应用特殊的引物片断扩增出待检标本中的上皮细胞源性mRNA，通过逆转录技术获得相应的上皮细胞源性cDNA，通过PCR的扩增而增加待检标本中上皮细胞源性cDNA的含量，从而在理论上可以提高异常细胞检出的敏感性。

4．2．2 具体方法 （1）逆转录聚合酶链反应（RTPCR）：RT-PCR技术通过监测上皮特异性mRNA或肿瘤特异性mRNA来发现乳腺癌患者骨髓、外周血或淋巴结中的播散肿瘤细胞。

（2）巢式（nested）PCR：先用一队外引物对模板进行扩增，然后再用另一对内引物扩增第一对引物扩增的产物。

（3）实时RT-PCR（real-time RT-PCR）：可以在PCR处于对数增长阶段时进行计数，而不需要经过固定的传代次数再进行计数，而且不需要在PCR反应结束后再进行产物处理，从而避免了PCR反应产物可能造成的污染。

5 主要的检测标记物

5．1 细胞角蛋白（CK）

细胞角蛋白是上皮细胞特有的中间细丝蛋白，细胞角蛋白家族至少包含20余种成员，每一种蛋白都由一种特异的基因所编码。CK-19主要分布于单层上皮细胞，如肠上皮、乳腺、胰管、子宫内膜等，当这些组织癌变后角蛋白的组成不变，但含量增加，从而被认为是检测上皮细胞来源的癌细胞的普遍标志物。

5．2 Mammaglobin

绝大多数的研究均证实，Mammaglobin仅表达于乳腺癌患者的外周血中，而不表达于正常人和乳腺良性疾病患者中；L.Mercatali等[2]应用巢式RTPCR的方法检测乳腺癌患者以及正常志愿者外周血中Mammaglobin mRNA的表达，结果7%的乳腺癌患者外周血中可以检出Mammaglobin mRNA表达，而正常志愿者全部未能检出，从而提示Mammaglobin作为检测乳腺癌播散肿瘤细胞的标志之一，具有极高的特异性。

5．3 Maspin

Maspin属于serpin蛋白酶家族，Maspin蛋白的表达可能与正常乳腺组织的癌变以及进展有关。I Bie`che等[3]利用实时定量RT-PCR技术检测Mapsin在乳腺癌组织中的表达，并讨论其与乳腺癌患者病理学特征以及预后之间的关系，结果发现Maspin的表达与患者ER表达呈负相关。

5．4 乳腺上皮粘蛋白（small beast epithelial mucin，SBEM）

乳腺上皮粘蛋白的表达具有高度的特异性，仅在乳腺和唾液腺中表达。杨华伟等[4]利用巢式PCR技术检测67例乳腺癌、16例乳腺良性肿瘤以及20例健康志愿者外周静脉血中SBEM mRNA的表达情况，结果67例乳腺癌患者外周血的表达率为50.7%（34/67），而良性肿瘤以及健康志愿者表达均为阴性，提示SBEM mNRA可作为检测乳腺癌血行微小转移的检测指标。SBEM mRNA的阳性表达率与临床分期、淋巴结受累情况明显相关，而与肿瘤的大小、激素受体情况等无关。

［1］ Braun S,Vogl FD,Naume B,et al:Apooled analysis ofbone marrow micrometastasis in breast cancer.N Engl J Med 353:793-802, 2005.

［2］ L.Mercatali,V.Valenti,D.Calistri,et al.RT-PCR determination of maspin and mammaglobin B in peripheral blood of healthy donors and breast cancer patients.Annals ofOncology17:424–428,2006

［3］ I Bie`che,I Girault,J-C Sabourin,S Tozlu,K Driouch,MVidaud and R Lidereau.Prognostic value of maspin mRNA expression in ERa-positive postmenopausal breast carcinomas.British Journal of Cancer(2003)88,863–870.

［4］ YangHW,CaoJ,YangNW,et al.Expression ofsmall breast epithelial mucin mRNA in peripheral blood of breast cancer patients and its clinical significance.Ai Zheng,2005,24(7):842-845.