安祯祥 何远利 王敏

(贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550001)

四氯化碳不同给药途径复合乙醇诱导大鼠肝纤维化模型的研究

安祯祥 何远利 王敏△

(贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550001)

目的 比较四氯化碳(CCL4)腹腔注射、皮下注射复合乙醇灌胃SD大鼠制备肝纤维化动物模型，为研究肝纤维化病理机制、治疗提供质量稳定可靠的动物模型。方法 SD大鼠40只随机分为四组，每组10只，腹腔注射造模组用50% CCL4橄榄油溶液腹腔注射(体积比：四氯化碳：橄榄油=1∶1)，剂量0.15 mL/100 g， 2次/周； 皮下注射造模组用50% CCL4橄榄油溶液背部皮下注射，剂量0.3 mL/100g， 2次/周，两组均在实验第2周开始给大鼠用30%乙醇灌胃，剂量1 mL/100g，隔天1次造模。腹腔注射对照组、皮下注射对照组，只采用等量橄榄油腹腔注射、皮下注射，生理盐水灌胃。对比研究CCL4不同给药途径复合乙醇灌胃建立大鼠肝纤维化模型的效果。结果 腹腔注射造模组第8周造模成功，造模结束时死亡3只，死亡率30%，皮下注射造模组第10周造模成功，造模结束时大鼠无死亡，两造模组比较，造模时间比较有显著性差异(P<0.01)，肝组织纤维化病理分级无显著性差异(P>0.05)。结论 两种方法均可成功建立肝纤维化模型，且各有优势，腹腔注射造模组成模时间短，有时间优势，但是死亡率高，皮下注射造模组成模时间长，死亡率低，有成活优势，可根据实验需求选择应用不同的方法构建动物模型。

肝纤维化； 四氯化碳； 乙醇； 复合法； 模型

肝纤维化动物模型的建立是开展肝纤维化防治研究的重要手段，也是进行人体研究的前提[1]。因此建立高效、质量稳定的肝纤维化动物模型显得尤为重要。CCL4作为一种典型的肝毒物质，可强烈地引起肝细胞坏死，一直被研究者用来诱发各种肝损伤模型以阐明化合物肝毒性机制或肝损伤保护机制[2]。CCL4可通过腹腔注射、皮下注射、灌胃、吸入等途径造模，单纯CCL4造模方法简单、价格低廉、病变典型，但是肝纤维化形成时间比较长，死亡率高。本实验拟就CCL4腹腔注射、皮下注射复合乙醇灌胃进行比较研究，探讨这两种复合方法各自的优劣，为肝纤维化动物实验选择造模方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠40只，SPF级，雌雄各半，体质量160～200 g，动物及饲料均由重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司提供，实验动物许可证号: SCXK(渝)2012-005。实验场所由贵阳中医学院实验动物中心提供。房间通风良好，保持清洁，温度20～25 ℃，空气湿度50%～70%，用标准大鼠箱饲养，每箱5只，水料充足。

1.2 主要试剂 四氯化碳 (天津市光复科技发展有限公司，批号20120506)；橄榄油为国产分析纯试剂；75%医用酒精；4%甲醛；生理盐水。丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒，贝克曼库尔特实验系统有限公司，批号2001-0367；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒，贝克曼库尔特实验系统有限公司，批号2001-0367。透明质酸(HA)，批号：20140709；层粘连蛋白(LN)，批号：20140720；IV型胶原(IV-C)，批号：20140816；Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢP)，批号：20140702，郑州安图生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 肝纤四项仪器为艾德康ADC CLIA 400，生化仪为德国西门子ADVIA 2400全自动生化分析仪，显微镜(奥林巴斯 BX51)，莱卡切片机RM2235。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 本实验分两种方法造模，腹腔注射造模组：CCL4腹腔注射+酒精灌胃，皮下注射造模组：CCL4皮下注射+酒精灌胃。将SD大鼠40只适应性喂养1周后，随机分为四组:腹腔注射造模组10只、腹腔注射对照组10只、皮下注射造模组10只、皮下注射对照组10只，腹腔注射造模组用50% CCL4橄榄油溶液腹腔注射(体积比=四氯化碳：橄榄油=1∶1)，剂量0.15 mL/100 g，2次/周，皮下注射组用50% CCL4橄榄油溶液背部皮下注射，剂量0.3 mL/100g，2次/周，并从实验第2周开始给大鼠用30%酒精灌胃，剂量1 mL/100g，隔天1次造模。大鼠每周称体质量1次，并按体质量增长而相应调整造模药物剂量。实验第8周，从两造模动物中各随机抽取1只大鼠处死，作肝纤维化病理学检查，按照《病毒性肝炎防治方案》[3]肝纤维化分期标准来判断肝纤维化程度，直到有2期以上肝纤维化形成，即确定肝纤维化模型复制成功，腹腔注射造模第8周即成功，皮下注射组造模第10周成功。

1.4.2 样品采集 各组大鼠每周称量体质量1次，观察每组体质量变化有无差异、进食量、毛色、活动状况等情况。各组于实验第8周各随机处死1只大鼠，行肝纤维化组织病理学检测。腹腔注射造模组第8周确定造模成功，皮下注射造模组第10周造模成功，各于造模结束后，禁食12 h，测体质量，腹主动脉采血，离心取血清，检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶及肝纤维化指标血清中HA、LN、IV-C、PⅢP含量。脱颈处死大鼠，剖取肝脏，提取肝组织做病理学检查。取各组肝脏右叶相同部位组织1块置入10%福尔马林固定，作常规石蜡切片，HE染色，按照《病毒性肝炎防治方案》[3]肝纤维化分期标准来判断肝纤维化程度，在光镜下观察肝内部结构、肝细胞炎症程度以及肝纤维化组织增生情况，每张切片随机选取5个视野，分别记录病理分级，并取其平均值作为该动物肝脏的病理分级。

2 结 果

第8周末随机处死各组大鼠1只，HE染色发现腹腔注射造模组纤维化已经形成，处死全部腹腔注射造模组大鼠及腹腔注射对照组大鼠，至第10周随机处死剩余各组大鼠各1只，HE染色发现肝纤维化形成，处死剩余两组大鼠。造模过程中皮下注射造模组大鼠无死亡，腹腔注射造模组共死亡大鼠3只，死亡率约30%，其余两组大鼠无死亡。

2.1 各组大鼠一般情况比较 各组大鼠入场时体质量差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。复合因素造模两组大鼠一般情况差，皮毛干涩无光泽，精神萎靡，行为迟钝，活动和饮食减少，有扎堆现象，体质量增长缓慢，两组相比无显著性差异。两组对照组大鼠一般情况良好，体质量增长差异无统计学意义(P>0.05)。造模过程中，腹腔注射造模组大鼠体质量增长缓慢，前两次造模中体质量呈负增长，在前6周，与腹腔对照组比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，皮下注射造模组体质量普遍有缓慢增长，低于对照组，差异无统计学意义(P>0.05)，与腹腔注射造模组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠体质量的变化(g，±s)

注：与腹腔注射对照组比较，*P<0.05。

2.2 各组大鼠血清纤维化指标、ALT、AST的比较 实验结束后，腹腔注射造模组、皮下注射造模组大鼠血清HA、LN均较各相应对照组升高，差异有统计学意义(P<0.01)，而腹腔注射造模组、皮下注射造模组差异无统计学意义(P>0.05)，IV-C、PⅢP实验各组比较差异无统计学意义(P>0.05)；谷丙转氨酶在腹腔注射造模组、皮下注射造模组较对照组有升高，差异无统计学意义，谷草转氨酶在腹腔注射造模组较其余各组有明显升高，差异无统计学意义，见表2。

表2 实验各组大鼠血清肝纤维化指标、ALT、AST检测结果(±s)

注：与腹腔注射对照组比较，*P<0.01，与皮下注射对照组比较，**P<0.01。

2.3 两造模组大鼠肝纤维化时间比较 腹腔注射造模组第8周造模成功，皮下注射造模组第10周造模成功，两组造模组比较，造模时间有显著性差异(P<0.01)。

2.4 各组大鼠肝组织纤维化病理学比较 两组对照组肝细胞结构正常，以中央静脉为中心放射状排列，无假小叶形成。造模两组肝小叶结构破坏，肝细胞明显坏死，纤维组织增生，多数形成假小叶，伴炎性细胞浸润，部分肝小叶中有坏死S2、S3、S4期情况：腹腔造模组分别为1、4、2，皮下造模组分别为3、5、1，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

肝纤维化模型主要有CCL4、二甲基亚硝胺、硫代乙酰胺、异种血清、乙醇、胆总管结扎等单因素造模和复合因素造模。单因素造模时间长，死亡率高，形成率低，病理分期不明显。复合因素造模可缩短造模时间，复合造模因素可产生协同作用，减少单一因素的强度，降低死亡率，增加成功率。CCL4是一种选择性的肝毒性物质，本研究使用橄榄油作为溶剂，按1/1体积比例能很好地溶解，方便、易于获得，是一种好的实验方法。CCL4诱导的肝纤维化动物模型在病理机制的某些方面与人肝纤维化相似，如肝细胞坏死后的再生、中央静脉周围肝细胞坏死及纤维组织增生，与人慢性肝病进展为肝硬化相似，但是CCL4的肝毒性作用剧烈，如剂量掌握不当，死亡率较高，且停止给药后有一定自然恢复趋势的缺点。CCL4给药方式国内外存在差异，国外主要采用腹腔注射， 国内主要采用皮下注射， 两种给药方式造模动物的死亡率均较高[4]。CCL4经门静脉到达肝脏，在肝细胞内经细胞色素氧化酶P450代谢生成大量的自由基，攻击肝细胞，使肝细胞发生凋亡或坏死，CCL4反复破坏肝细胞， 结果造成肝脏的炎症迁延，不断形成纤维化。乙醇在肝脏通过乙醇脱氢酶( ADH) 和微粒体乙醇氧化酶系统( MEOS) 进行氧化代谢产生毒性代谢产物乙醛，通过肝细胞损害、诱导免疫反应、抑制三羧酸循环等多种途径损害肝脏的结构和功能，刺激胶原蛋白的合成，从而促进肝纤维化的发生[5]。乙醇能诱导P450活性从而增加CCL4的肝毒性，在乙醇致肝脂肪变作用下用CCL4能加速肝细胞坏死，缩短造模时间[6]。本实验结果显示，腹腔注射、皮下注射复合乙醇造模均可诱发大鼠肝纤维化的形成，腹腔注射复合乙醇灌胃成模时间为第8周，较皮下注射复合乙醇造模提前两周，有时间优势，虽然腹腔注射CCL4剂量小，但死亡率高(30%)，考虑原因系腹腔注射后腹膜吸收面积大，CCL4一次性进入血液循环量大，导致肝细胞严重坏死，发生急性肝衰竭而死亡，更多的显示为急性肝功能损伤，大鼠只要能耐受前期实验，后期就可发生肝纤维化，皮下注射虽然剂量偏大，但是吸收慢，对肝脏毒性相对偏小，大鼠能耐受，表现慢性肝功能损害，所以形成肝纤维化时间相对偏长，死亡率低是其优势。从对转氨酶、HA、LN的检测结果可以发现，腹腔注射复合乙醇造模组均较对其余各组有升高，亦支持上述结论。本实验研究结果显示：造模两组大鼠肝内结构紊乱，均形成肝纤维化，两种方法均能成功建立肝纤维化动物模型。腹腔注射复合法造模时间为第8周，较皮下注射造模组缩短时间两周，有时间优势，但死亡率高达30%，皮下注射复合法造模时间长，死亡率低是其优势。复合因素中的CCL4可模拟氧化损伤，乙醇模拟酒精中毒，均能损伤肝细胞，损伤的肝脏可进一步发生纤维化，较单因素模型具普遍性和现实意义，与肝纤维化的形成机制贴近，能更准确模拟自然生活环境，适用于抗肝纤维化的作用机制研究，在实验中可根据实验需求选择应用。

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Preparation of hepatic fibrosis rat models induced by carbon tetrachloride administration in different ways combined with ethanol lavage

AnZhenxiang,HeYuanli,WangMin.

FirstAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001,China

Objective To provide reliable hepatic fibrosis rat models for the research on the pathologic mechanism and the treatment of hepatic fibrosis through the comparison of the models induced by gastric administration of ethanol combined with different CCL4 injection ways (intraperitoneally and subcutaneously respectively). Methods 40 SD rats were randomly divided into 4 groups (10 rats in each group): intraperitoneally-injected group, injection of 50% of CCL4and olive oil (volume ratio, CCL4∶ Olive Oil = 1∶1 ) at the dosage of 0.15 mL/100g, twice per week; subcutaneously-injected group, injection of 50% of CCL4and olive oil under the dorsal tissue at the dosage of 0.3 mL/100g, twice per week. Both of the two groups were gastrically administrated with 30% of ethanol every two days at the dosage of 1 mL/100g in the second week of the experiment; the other two control groups were only injected the same amount of olive oil intraperitoneally and subutaneously respectively with gastric administration of normal saline. Then the models prepared by different administration of CCL4with ethanol were compared. Results Intraperitoneally-injected group was successfully modeled in 8 weeks with the death of three rats (the mortality rate was 30%), while subcutaneously-injected group was modeled in 10 weeks without the death of any rat. There was significant difference in modeling time (P<0.01) but no significant difference in pathological grading on hepatic fibrosis(P>0.05) between the two groups.Conclusion Both the two different administration ways of CCL4could successfully create hepatic fibrosis rat models. Intraperitoneal injection has an advantage in modeling time but its mortality rate is a bit high. However, subcutaneous injection has the advantage in mortality rate but its modeling time is longer. Thus, we could select different CCL4administration ways according to different experimental purpose.

Hepatic fibrosis; Carbon tetrachloride (CCL4); Ethanol; Composite method; Model

国家自然科学基金资助项目(81460726)；贵州省教育厅自然科学研究招标资助项目(合同编号： 黔教合KY字(2012)(41)号)；贵州省科技厅社会发展资助项目(合同编号： 黔科合SY字(2012)3146)

R-332,R575

A

1000-744X(2016)01-0006-03

2015-10-02)

△通信作者