黄阜峰

（湖北师范大学生命科学院，湖北黄石 435002）

粘果山羊草及其祖先种的染色体原位杂交研究

黄阜峰

（湖北师范大学生命科学院，湖北黄石 435002）

利用人工合成的（AAG）5寡集核苷作为探针，对异原多倍体－粘果山羊草Ae．kotschyi（SKUK）及其祖先种小伞Ae．umbellulata（U）和沙融山羊草Ae．sharonensis（S）的中期染色体进行了原位杂交研究。揭示出了粘果山羊草（SKUK）与其祖先种小伞（U）和沙融（S），集中成簇分布的寡集核苷序列在其基因组中的总量和分布位点有着明显差异。SkUk基因组中集中成簇分布的AAG序列的总量和位点数量多，分布区域广泛，每对染色体上均有2个以上的分布位点（多的可达5），分布于染色体的近着丝粒区域、长臂、短臂或端粒。而S或U基因组中集中成簇分布的AAG序列的总量和位点数量少，分布区域窄，平均每条染色体不到一个，主要分布于近着丝粒区域或短臂，部分染色体没有。并结合已有的文献报道，探讨了AAG序列在粘果山羊草和其祖先种小伞和沙融基因组中的变异与进化的关系。

异源多倍体；粘果山羊草；SSRs；FISH；基因组变异

山羊草属的多倍体是由少数几个同属的2倍体物种杂交加倍而形成的异源多倍体，它们的多倍体基因组来源的祖先种谱系基本清楚，且杂交组合多样，种类丰富［1］。因此是研究多倍体进化的很好的材料。新近的研究表明，在多倍体形成过程中，两个异质的基因组进入一个（仅含有两亲本之一的细胞质）核中，不再单独进化，而是共同进化，且导致基因组的迅速改变和后生改变［2］。这些改变包括在基因组内和基因组间的染色体交换、大片段DNA的转移［3］、基因的突变和消除［4］、基因的甲基化沉默［5］。然而对由重复序列的改变而引起的山羊草多倍体化后染色体结构的改变研究得很少。

FISH技术是研究异源多倍体的起源，以及与进化相联系的染色体结构变化的一个有用的工具［6］。除类似于转座子，弥散地分布整个基因组的高度重复系列不适合作为染色体的标记外，rRNA基因，个别的重复系列克隆可用于山羊草多倍体的染色体结构的改变的研究［7］。例如：rRNA基因的原位杂交表明山羊草多倍体和它的祖先种在经历的长时间的平行进化后，在多倍体中5SRNA基因个数比期望数减少，大小发生变化，以及出现在染色体上的位置也有改变［8］。然而，利用简单重复序列的原位杂交比较山羊草多倍体和它的祖先中的染色体结构变异及它们的平行进化关系，未见报道。

简单重复序列（SSRs）由大约1～6核苷的短的重复单元组成。据报道，少数SSRs弥散地散布于整个基因组，是遗传基因作图的分子标记。而多数SSRs集聚成簇出现在染色体上，构成染色体的高度有序的结构，并具有基因组和染色体组织的特异性。其中的AAG在基因组中成簇出现的概率最大，广泛分布于着丝粒或染色体中部，是应用原位杂交技术研究染色体结构的有用序列［9］［10］。

粘果山羊草是由小伞和沙融杂交而形成的异源多倍体［1］。本研究拟应用人工合成的寡聚核苷，（AAG）5这个SSR重复系列作为探针，通过原位杂交着色粘果山羊草及其祖先种小伞和沙融的染色体。选择用AAG作为探针是因为它们在麦类基因组中含量丰富，且成簇分布，通过原位杂交能得到图案丰富的杂交图谱，提供大量的有关染色体结构的信息［10］。我们的目标是通过原位杂交得到三个种的FISH图谱，识别染色体，了解AAG高度重复序列在基因组中的分布，比较粘果山羊与祖先种小伞，沙融的染色体结构的差异，进而研究基因组的进化及与SSRs的关系。

1 材料

1．1 粘果Ae．kotschyi Boiss、小伞Ae．umbellulata Zhuk、沙融山羊草Ae．sharonensis种子由中国农业科学院作物资源研究所提供。

1．2 探针（AAG）5由Sigma公司合成

2 方法

2．1 制备中期染色体标本

种子25℃催芽48h，切取根尖加入0．2%的秋水仙素，4℃处理24h，卡诺氏固定液固定，酶解，火焰干燥法制备中期染色体标本。

2．2 原位杂交方法

染色体原位杂交实验按Li等［11］的方法并略作修改，每一张片子40μL杂交液，内含50%的去离子甲酰胺（Sigma），10%的硫酸葡聚糖（Sigma），100ng／μL鲑鱼精子ssDNA（Sigma），2× SSC，盖片用22mm×22mm的盖玻片，90℃共变性3min，放保湿皿中37℃杂交过夜。

2．3 信号检测

染色体原位杂交信号的检测与洗脱仍然按Li等［11］的方法。杂交后的载玻片用2×SSC在常温洗10min，37℃洗10min，再用1×PBS常温洗一次，然后进行检测。地高辛标记的探针第一步反应加入羊抗地高辛抗体（anti－di－goxigenin－FITC，Roche），37℃温育30min后再用1×PBS常温洗3次，每次5min，第二步信号放大反应加入兔抗羊地高辛偶联物（rabbit anti－sheep－FITC，Roche），温育和洗脱同第一步。

2．4 图像检测及分析

染色体载片使用5μL／mL DAPI（4′，6－diamidino－2－phenylindole）复染，再加抗淬灭剂，用O－lympus BX60型荧光显微镜观察杂交信号，Photometrics SenSys CCD1400E摄影装置和Metamorph4．6．3软件获得图像，Photoshop10．1．1软件进行图片处理。染色体分析，应用AAG探针杂交得到的染色体信号带，结合rRNA基因和重复序列的原位杂交数据，识别粘果山羊草的二个基因组（SKUK）的染色体及小伞、沙融的染色体。

图1 （AAG）5探针荧光原位杂交染色体图，A粘果山羊草，B沙融山羊草，C小伞山羊草

3 结果与分析

3．1 原位杂交结果

利用Dig－dUTP标记的工人合成的寡聚核苷（AAG）5探针分别对粘果山羊草及其祖先种—小伞、沙融山羊草的中期染色体进行了荧光原位杂交，同时利用DAPI着色染色体，蓝色为染色体，绿色的为染色体上的杂交信号。结果如（图1）所示，三个种的基因组的几乎所有染色体上均有杂交信号，明亮大斑点信号，主要分布在染色体的着丝粘区域，其次部分染色体的长短臂中部，也有几个出现在染色体的端粒。这与A．Cuadrado研究禾木科植物的SSR高度重复系列，成片集中分布于染色体的着丝粒的结果基本一致［9］。也有不一致的地方，如沙融山羊草，除着丝粒大信号斑处，每条染色体的其它区域也弥散地分布着众多的小信号斑点。

3．2 核型分析

作者应用核型分析比较了粘果山羊草及其祖先种——小伞，沙融山羊草SSR分布的特征（图2）。

图2 核型图，上排左沙融山羊草（S基因组），上排右小伞山羊草（U基因组），下排左粘果山羊草（Sk基因组）下排右粘果山羊草（Uk基因组）

粘果山羊草的Sk基因组：①着丝粒部位，5对染色体的着丝粒有强烈的杂交信号（SK1，SK2，SK4，SK5，SK7），一对染色体着丝粒有较强的杂交信号（SK3），一对染色体无着丝粒信号，②染色体长短臂中部，5对染色体（SK1LR，SK2L，SK4LR，SK5LR，SK6LR）较强的信号，2对染色体具较弱的杂交信号（SK3LR，SK7L）。③端粒部位，6对染色体具（SK1L，SK2L，SK3L，SK4L，SK5L，SK6R）较强的信号。表明SSR序列主要集中分布于着丝粒，其次分布于长臂中部，也会出现在端粒。

粘果山羊草的Uk基因组：①着丝粒部位，4对染色体有强烈的信号（UK2，UK3，UK4，UK5），1对染色体较强的信号（UK7），2对染色体较弱的信号，②染色体长短臂中部，3对染色体具有强烈信号（UK3R，UK4LR，UK5LR），4对具有较强或弱的信号（UK1L，UK2LR，UK6L，UK7L）。③端粒部位，5对染色体具端粒信号都较弱（UK1L，UK2LR，UK3L，UK5L，UK6L，UK7LR）。表明所有染色体的着丝粒，中部，端粒部位，都具有成片集中分布的SSR序列，但集中程度，拷贝数量有所不同。

沙融山羊草的S基因组：①着丝粒部位，1对染色体具明亮信号（S2），3对染色体具有较弱信号（S1，S3，S6），其它未见信号。②染色体长短臂中部，仅4对染色体见到较弱的信号（S1R，S2LR，S4LR，S7R）。③端粒部位，未见端粒信号。表明在整个S基因组有成片集中分布的SSRs序列，但数量较少，位点也少。

小伞山羊草的U基因组：①着丝粒部位，3对染色体具有较强信号（U2，U4，U5），4对染色体具有较弱信号（U1，U3，U6，U7），②染色体长短臂中部，2对染色体具有较强信号（U3L，U5R），③端粒部位，2对染色体具有较强信号（U3L，U4L）。表明U基因组，具有较丰富的SSRs序列，出现的位点也较多。

4 讨论

植物基因组中存在着大量的丰富的AAG基序的简单重复序列，关于这一点是没有疑问的。然而关于三核苷基序的简单重复序列在基因组中的分布存在着分歧。据已测序的物种的序列对比和其它物种的EST数据，三核苷基序的简单重复序列以200－300bp的长度主要随机地散布于基因组的编码区。然而，从我们研究的三个山羊草物种小伞、沙融、粘果的染色体的FISH结果来看，三个山羊草物种的染色体上有着丰富的，大量的、多态的、大的信号斑。而植物FISH技术要求目标片段的长度在10kb左右［12］，才会有可探测到的杂交信号。据此推断这些区域中有大量的长的串连重复的AAG序列，或者染色体的三维结构上集中排列了大量的AAG序列。揭示了一些长的、大的AGG重复序列非随机地分布于特定区域，表现出基因组的特异性。这个结果与研究大麦、小麦得到的结果是一致的［10］，而与EST的结果相反。

小伞、沙融的AAG原位杂交信号主要分布于近着丝粒区域，粘果的原位杂交信号分布于近着丝粒／着丝粒或长短臂中间，或近端粒／端粒。与小伞、沙融、粘果山羊草染色体的C－带或N－带的分布区域部分重叠［13］，揭示AAG与异染色质有关。

粘果山羊草是由小伞和沙融山羊草杂交后多倍化而形成的一个异源四倍体物种。FISH结果表明S、U基因组和SkUk基因组的杂交信号的大小、数量及在染色体上的分布图案存在着广泛的差异，揭示出粘果山羊草与它的祖先种小伞和沙融、山羊草基因组的进化是不同步的。

比较S、U和SK、UK基因组的杂交图案可以看出，S基因组除2S染色体有一个明亮的着丝粒信号斑外，其它染色体有一个较暗、较小的（或偶有两信号）分布染色的近着丝粒／着丝粒或短臂上。然而SK基因组，每条染色体都有多条（最多达5条）明亮的信号，分布于近着丝粒／着丝粒或长短臂中间，或近端粒／端粒。这一结果揭示了粘果山羊草（SK和Uk）基因组的成簇的串联的长的AAG相对于祖先种－沙融山羊草U基因组和小伞的U基因组的分布区域扩大，出现了众多新的分布位点。暗示SK和UK基因组都被大量的修改，这与SK的18－26srDNA的研究结果相一致，而与Uk的结果相反［13］。

同样，比较粘果山羊草和它的祖先种小伞和沙融的杂交信号的数量和信号斑点的大小，发现，粘果山羊草的S基因组的大的杂交信号明显比沙融的S基因组要多。多数斑点也较大，这揭示了粘果山羊草基因组（SkUk）集中成簇连绵分布的三核苷基序的SSR的数量比其祖先种小伞U和沙融S明显要多很多。这似乎指向异源多倍体经历了杂交加倍初期的基因组的剧烈变化和后生变化，三核苷基序的SSR在基因组中被大量的扩增。

我们还能发现一个有意思的现象就是用AAG探针与沙融山羊草与中期染色体杂交，发现除观察到少数几个大的信号斑外，还观察到了为数众多的小的且清晰可见的信号斑点，散布于所有染色体的长、短臂上，而在S基因组中没有观察到。揭示出存在于S基因组的较小的成簇分布的AAG序列在SK基因中消失了。

新近研究人工合成的沙融×小伞的结果证实，多倍体的基因组是非加性的，存在着DNA序列转移，消除和COPY数量的变化，同时研究者也发现那些人工合成的异源多倍体在基因组组成上与自然生成的异源多倍体较为相似，而发生基因组整合的方向也是一致的［4］。我们的研究结果也佐证了这一观点，粘果山羊草（SK、UK）的信号斑点大，且较明亮，以及AAG与沙融杂交的弥散分布于整个基因组的小的信号斑点，在Sk基因组的杂交中消失。揭示出自然形成的异源多倍体的一些DNA序列消除。而且在SK、UK中大的杂交信号斑点的数量增多，位置的多态性增加，同样揭示了序列的转移和扩增。

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FISH study of chromosome for Ae．kotschyi and its ancestral species HUANG Fu－feng

（College of Life Sciences，Hubei Normal University，Huangshi 435002，China）

In this paper，the use of a synthetic oligonucleotides of the（AAG）5Set nucleoside as probes for allopolyploid－Ae．kotschyi（SKUK）and its ancestral species－Ae．umbellulata rundlet（U）and Ae．sharonensis sand melt goat grass（S）of metaphase chromosomes in situ hybridization studies．Reveals Ae．kotschyi（SKUK）and its ancestral species umbrella（U）and sand melt（S），focused on two oligonucleotide sets nucleotide sequences clustered distribution of the total amount and distribution sites in its genome in a significant difference．SkUkgenome more concentrated in clusters and the total number of sites distributed AAG sequences，widely distributed areas，each chromosome pair has two more distribution sites，（and more up to 5），located in chromosome near the centromere region，long arm，short arm or telomeres．While the total number of sites and S or U genome centralized cluster distribution AAG sequences less narrow distribution area，an average of less than one per chromosome，（not part of the chromosome），mainly in the area near the centromere or short arm．And combined with the existing literature on the relationship between the evolution of the genome sequence of SSR were discussed．

allopolyploid；Ae．kotschyi；SSRs；FISH；genome evolution

Q－343

A

1009－2714（2016）04－0006－05

10．3969／j．issn．1009－2714．2016．04．002

2016—04—20

黄阜峰（1962— ），男，副教授，主要研究方向为细胞遗传学．