高 倩，胡言青，唐懿挺，牟玉莲

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）

Wip1过表达转基因小鼠模型的制备与鉴定

高 倩，胡言青，唐懿挺，牟玉莲＊

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）

摘 要：本研究旨在构建Wip1过表达转基因小鼠，并对Wip1过表达转基因小鼠进行RNA水平上的筛选，为研究动脉粥样硬化的发生机制提供一种动物模型。通过逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）获得小鼠组织的cDNA，并以其为模板进行PCR扩增，对扩增片段进行胶回收，然后进行扩增片段和空载体的双酶切，将酶切后胶回收得到的Wip1基因全长与载体pcDNA3.1（＋）进行连接，获得Wip1－pcDNA3.1（＋）过表达载体，最终得到Wip1过表达转基因原代小鼠，并利用Southern blotting方法和实时荧光定量PCR方法对小鼠进行鉴定筛选。试验获得Wip1过表达转基因原代小鼠30只，利用Southern blotting方法鉴定出阳性小鼠11只，阳性率为36.67%，实时荧光定量PCR筛选Wip1过表达转基因小鼠阳性率为32.84%。以上结果表明，试验成功构建了Wip1－pcDNA3.1（＋）过表达载体，并且经过Wip1基因在小鼠组织DNA和RNA水平上的鉴定筛选，成功获得了Wip1过表达转基因小鼠。

关键词：Wip1；过表达；小鼠模型

野生型P53诱导的蛋白磷酸酶1（wild－type p53－induced phosphatase，Wip1）是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶，属于PP2C（serine／threonine specific protein phosphatase type 2c，PP2C）家族，并由PPM1D（protein phosphatase magnesium－dependent 1delta，PPM1D）基因编码［1］，在小鼠上，该基因位于11号染色体上，而人的Wip1基因位于17q23／q24处，其蛋白分子质量约为61ku［2］。

丝／苏氨酸蛋白磷酸酶家族中与肿瘤的发生和发展有直接关系的成员极少，但Wip1就是该家族中一个真正具有致癌作用的基因，是一种新的原癌基因［3］。Wip1具有多方面的功能，在细胞生长发育、DNA损伤修复、肿瘤发生、细胞稳态、生殖、疾病等状态中均起着重要的调节功能。有许多文献都指出Wip1基因敲除能够导致成纤维细胞的生长速度减慢，也能够导致细胞早衰［4－6］，在DNA的损伤修复过程中，Wip1基因承担着抑制剂或者是调控子的角色。Wip1致癌基因在侵略性成神经管细胞瘤变体的发生和侵袭中也起到了促进作用［7］。Wip1能够在正常的无应激存在的情况下使得由p53来维持的细胞／组织达到内稳态［8］。此外，小鼠在敲除Wip1基因后，表现出了生殖器官的缺陷、免疫功能降低以及细胞周期调控的紊乱［2］。目前，除了上述研究Wip1基因与DNA损伤修复、细胞生长发育、肿瘤发生、生殖的关系以外，也有关于Wip1基因与动脉粥样硬化间关系的研究。动脉粥样硬化的发生起始于自由基对低密度脂蛋白分子（low density lipoprotein，LDL）的氧化［9］，巨噬细胞摄入被氧化了的低密度脂蛋白分子（oxidized low density lipoprotein，oxLDL），会使细胞内的胆固醇以脂滴的形式得以累积，然后形成泡沫细胞［10］。新加坡科学家Le等［11］证明，Wip1缺失能够抑制巨噬细胞转化为泡沫细胞，证实了自噬、肥胖和动脉粥样硬化均受到细胞自噬活性的调节，均依赖Wip1的调节，Wip1通过ATM－mTOR途径抑制细胞自噬活性，进而调控脂肪的堆积以及动脉粥样硬化的形成。据此，推测Wip1基因的过表达可能会加速动脉粥样硬化的形成。

目前，已经有一些大动物的动脉粥样硬化模型［12－13］，如果能成功构建小鼠动脉粥样硬化模型，会为研究动脉粥样硬化提供更便利的条件和更全面的参考。本试验拟通过建立Wip1过表达小鼠模型，为进一步构建小鼠动脉粥样硬化模型及研究动脉粥样硬化的形成提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物 野生型C57小鼠及Wip1过表达转基因小鼠均饲养在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所猪基因工程与种质创新团队实验室SPF级鼠房中。

1.1.2主要试剂 RNA PCR试剂盒（该试剂盒中的反转录酶是由AMV分离而来）、T4DNA Ligase、BamHⅠ限制性内切酶、HindⅢ限制性内切酶、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、DNA Marker及5×Buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司；E.Z.N.A.Gel Extraction Kit Spin Protocol试剂盒及E.Z.N.A.EndoFree Plasmid Mini Kit均购自Omega Bio－Tek公司；Trizol及SYBR荧光试剂均购自Life Technologies公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；高纯RNA快速提取试剂盒、E×Taq酶及反转录试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；Tris－饱和酚、Taq酶、DIG Easy Hyb、CDP－Sta、PCR DIG Probe Synthesis Kit及阳性尼龙膜均购自Roche公司。

1.2方法

1.2.1Wip1基因编码区的扩增 根据小鼠Wip1基因cDNA全序列（GenBank登录号：NM＿016910.3），通过SignalP软件和DNAMAN 6.0软件分析扩增片段内部所含酶切位点，使用引物设计软件Primer Premier 6.0和Oligo 6.0设计1对特异引物，对Wip1基因的CDS序列进行扩增，用DNAMAN对序列内的酶切位点进行检查，排除内部酶切位点，并于上、下游引物中分别加入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。上游引物（Wip1F）：5′－CCCAAGCTTATGGCGGGGCTGTACTCGCTG－3′；下游引物（Wip1R）：5′－CGGGATCCTCAGCACACACACACTGG－3′，预期扩增目的片段长度为1 814bp。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。按照RNA提取试剂盒说明书提取小鼠睾丸组织的总RNA，以Oligo－dT为引物，使用AMV反转录酶合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，利用上、下游引物进行编码区的扩增。

1.2.2扩增片段的回收、扩增片段和连接载体的双酶切 按照E.Z.N.A.Gel Extraction Kit Spin Protocol试剂盒的操作步骤进行上述扩增片段的回收，然后将要连接的空载体pcDNA3.1（＋）质粒与上述扩增的片段用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切，37℃酶切3h，酶切产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进行酶切后胶回收。

1.2.3Wip1－pcDNA3.1（＋）过表达载体的获得将酶切后胶回收得到的Wip1基因全长和载体pcDNA3.1（＋）质粒在T4DNA连接酶作用下进行定向连接，从而构建重组质粒Wip1－pcDNA3.1（＋）。将重组质粒Wip1－pcDNA3.1（＋）转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中摇菌扩大培养，然后提取质粒送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。将含无突变、无缺失质粒的菌株再扩大培养，最后提取无内毒素质粒备用。

1.2.4Wip1过表达转基因小鼠的制备、鉴定及扩繁 将上述提取的Wip1－pcDNA3.1（＋）无内毒素重组质粒进行线性化后送往中国医学科学院医学实验动物研究所制备Wip1过表达转基因小鼠。利用Southern blotting方法对获得的小鼠进行DNA水平上的鉴定。Southern blotting免疫印迹技术操作主要步骤为：先提取小鼠的基因组DNA并进行质量检测，制备包含pcDNA3.1启动子和Wip1 CDS部分序列的探针，对基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳后进行DNA的转移和固定，最后进行DIG杂交和免疫检测。经过鉴定的小鼠用于配种、扩繁。小鼠在进入SPF级鼠房先适应新环境1周后再进行配种。SPF级鼠房具备智能温控（保持25℃左右）、智能光照（12h光照，12h黑暗），小鼠自由采食和饮水，配种后获得具有相同来源、共同饲养环境下的Wip1过表达转基因小鼠。上述涉及到的所有试验动物的相关试验操作均按相关操作规范进行。

1.2.5扩繁的Wip1过表达转基因小鼠的筛选、鉴定 利用实时荧光定量PCR技术对扩繁的Wip1过表达转基因小鼠进行筛选。采集待鉴定小鼠的鼠尾，置于Trizol中进行裂解，接下来按照RNA提取试剂盒说明书提取组织的总RNA，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，然后通过实时荧光定量PCR技术检测小鼠组织中的Wip1表达水平。利用引物设计软件Primer Premier 6.0设计Wip1及GAPDH的上、下游引物，引物序列见表1。

表1　引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果与分析

2.1Wip1－pcDNA3.1（＋）过表达载体构建

为了制备Wip1过表达转基因小鼠，需要先构建过表达载体。首先将要连接的空载体pcDNA3.1（＋）质粒与扩增的含编码区的PCR产物进行HindⅢ和BamHⅠ双酶切以获得含有互补的黏性末端的DNA片段。所获得的Wip1－pcDNA3.1（＋）载体长度约为7 242bp。对含有该大小质粒的菌液进行PCR扩增，检测到的片段大小为1 814bp，符合预期结果并将该质粒送测序，确认序列正确无突变缺失。同样，对该过表达载体Wip1－pcDNA3.1（＋）质粒用ScaⅠ线性化处理后得到的线性载体片段为7 242bp（图1），从而进一步确认成功构建了Wip1－pcDNA3.1（＋）过表达载体（图2）。

2.2原代小鼠的整合检测

通过显微注射方法获得原代小鼠30只，利用Southern blotting方法对获得的原代小鼠进行DNA水平上的鉴定，检测到阳性小鼠为11只，阳性率为36.67%。对鉴定得到的转基因小鼠进行扩繁、备用。

Southern blotting结果显示，在待鉴定的1～10号原代小鼠中，3、5、6、7及10号原代小鼠均出现3条特异性条带（最下面1条大小为596bp，是与探针特异性结合的条带），为Wip1过表达转基因小鼠（图3）。

图1　Wip1－pcDNA3.1（＋）载体的构建Fig.1 The constrction of Wip1－pcDNA3.1（＋）vector

图2　Wip1－pcDNA3.1（＋）载体构建图Fig.2 The drawing of Wip1－pcDNA3.1（＋）vector

图3　部分原代小鼠的Southern blotting鉴定Fig.3 Southern blotting identification of part of the founder mouse

2.3 扩繁的Wip1过表达转基因小鼠的筛选鉴定

将获得的阳性鼠进行合笼，经传代产后代小鼠204只，实时荧光定量PCR检测阳性67只，阳性率32.84%，筛选与对照组小鼠相比表达水平存在显著差异的个体，以建立Wip1过表达转基因小鼠家系。

2.3.1组织RNA及cDNA的质量检测 采集小鼠鼠尾组织提取RNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示检测到了18S和28S两条条带（图4）。反转录得到cDNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示仅检测到一条特异性条带（图5），说明提取的RNA和反转录得到的cDNA质量较好，适宜进行下一步的实时荧光定量检测。

图4　RNA电泳质量检测Fig.4 RNA quality detection by electrophoretic analysis

图5　cDNA电泳质量检测Fig.5 cDNA quality detection by electrophoretic analysis

2.3.2Wip1过表达小鼠的筛选鉴定 由图6可知，与74号野生型对照组小鼠组织中Wip1mRNA表达水平相比，68号和70号小鼠的Wip1mRNA表达水平极显著升高（68号：P＝0.0007，70号：P＝0.0001），说明68号和70号小鼠为筛选出的Wip1过表达小鼠，可以将转基因Wip1稳定遗传给后代。

图6　实时荧光定量PCR检测Fig.6 Real－time PCR detection

3 讨 论

Wip1是于1997年通过基因筛选法首次被发现命名的，是一种新的转录物，该转录产物以一种p53依赖的方式来表达，并且响应电离辐射（ionizing radiation，IR）诱导产生，与丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶（type 2Cprotein phosphatase，PP2C）同源。Wip1mRNA在电离辐射后快速生成，其翻译生成的蛋白在细胞核表达。Wip1可能会以p53依赖的方式对DNA的损伤产生响应来协助生长抑制通路的激活［14－15］。小鼠的Wip1基因包含了6个外显子和5个内含子，整个Wip1的DNA长度跨越超过36kb，外显子的范围在125～558bp，第1个内含子的大小未知，但是至少跨越16kb，该蛋白的分子质量约为66ku。目前，已知的Wip1靶向蛋白至少有7种：P53（p53kinase）、P38（p38kinase）、ATM（serine／threonine kinase）、Mdm2（MDM2protooncogene，E3ubiquitin protein ligase）、Chkl（choline kinase 1）、Chk2（choline kinase 2）和UNG2（uracil－DNA glycosylase）［15－20］，而对Wip1的研究主要集中于Wip1的靶向位点及去磷酸化位点。Wip1具有多方面的功能，对细胞生长发育、DNA损伤修复、肿瘤发生、细胞稳态、生殖、炎症、疾病等均起着重要的调节作用。

本研究通过显微注射的方法，获得了Wip1过表达转基因小鼠，并通过PCR、Southern blotting及实时荧光定量PCR检测证明构建的转基因小鼠模型是成功的。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）由多种因素参与，其病变主要累及到大、中动脉内膜及中层等结构，是一种以脂质沉积和慢性炎性细胞浸润为特征的病理生理过程，是心脑血管疾病的一个重要的诱因。Wip1是一个已知的ATM和p53的调节因子，ATM和p53在动脉粥样硬化的调节中起作用［21－24］。研究表明，Wip1可以通过ATM－mTOR途径抑制细胞自噬活性，从而控制脂肪堆积和动脉粥样硬化的形成。而在饲喂高能饮食的小鼠中，若将Wip1基因敲除，不仅能抑制巨噬细胞转变成泡沫细胞，还能够减轻动脉粥样硬化噬斑的形成［11］。因此，本研究中构建的Wip1过表达转基因小鼠是否易得动脉粥样硬化是今后研究的一个重点，这将为Wip1基因的敲除可以减缓动脉粥样硬化的发生提供佐证，也为研究Wip1影响动脉粥样硬化的发生机理提供基础，同时将大大有助于开展以Wip1为分子靶点的靶向药物研究与开发。

本试验结果表明，试验制备的Wip1过表达转基因小鼠可以传至下一代。虽然目前对Wip1基因的研究有一定的进展，但远远不够，而且很多机制并不明确。尤其对其在癌症患者中高表达的机制以及如何参与慢性疾病的发病过程并不清楚，因此，下一步也可以从Wip1生物学功能及小鼠培育等多方面进行深入研究。

4 结 论

本试验成功构建了Wip1－pcDNA3.1（＋）过表达载体，并且经过Wip1基因在小鼠组织DNA和RNA水平上的鉴定筛选，成功获得了Wip1过表达转基因小鼠，为研究动脉粥样硬化的发生机制提供了一种动物模型。

参考文献：

［1］ Choi J，Appella E，Donehower L A.The structure and expression of the murine wildtype p53－induced phosphatase 1（Wip1）gene［J］.Genomics，2000，64（3）：298－306.

［2］ Lowe J，Cha H，Lee M O，et al.Regulation of the Wip1phosphatase and its effects on the stress response［J］.FrontiersinBioscience，2012，17：1480－1498.

［3］ Bulavin D V，Demidov O N，Saito S，et al.Amplification of PPM1Din human tumors abrogates p53tumorsuppressor activity［J］.NatureGenetics，2002，31（2）：210－215.

［4］ Song J Y，Ryu S H，Cho Y M，et al.Wip1suppresses apoptotic cell death through direct dephosphorylation of BAX in response to gamma－radiation［J］.Cell Death＆Disease，2013，4（8）：120－130.

［5］ Yin H，Yan Z，Liang Y，et al.Knockdown of protein phosphatase magnesium－dependent 1（PPM1D）through lentivirus－mediated RNA silencing inhibits colorectal carcinoma cell proliferation［J］.TechnologyinCancerResearch＆Treatment，2013，12（6）：537－543.

［6］ Bulavin D V，Phillips C，Nannenga B，et al.Inactivation of the Wip1phosphatase inhibits mammary tumorigenesis through p38MAPK－mediated activation of the p16（Ink4a）－p19（Arf）pathway［J］.NatureGenetics，2004，36（4）：343－350.

［7］ Buss M C，Remke M，Lee J，et al.The WIP1oncogene promotes progression and invasion of aggressive medulloblastoma variants［J］.Oncogene，2015，34：1126－1140.

［8］ Park H K，Panneerselvam J，Dudimah F D，et al.Wip1contributes to cell homeostasis maintained by the steady－state level of Wtp53［J］.CellCycle，2011，10（15）：2574－2582.

［9］ Hansson G K，Libby P.The immune response in atherosclerosis：A double－edged sword［J］.Nature ReviewsImmunology，2006，6（7）：508－519.

［10］ Glass C K，Witztum J L.Atherosclerosis：The road ahead［J］.Cell，2001，104（4）：503－516.

［11］ Le G X，Brichkina A，Huang Y F，et al.Wip1－dependent regulation of autophagy，obesity，and atherosclerosis［J］.CellMetabolism，2012，16（1）：68－80.

［12］ Hamamdzic D，Wilensky R L.Porcine models of accelearated coronary atherosclerosis：Role of diabetes mellitus and hypercholesterolemia［J］.Journalof DiabetesResearch，2013，2013（1）：86－89.

［13］ Vilahur G，Padro T，Badimon L.Atherosclerosis and thrombosis：Insights from large animal models［J］.JouralofBiomedicine＆Biotechnoligy，2011，2011（1）：907575.

［14］ 张 伟，顾 勇，罗红鹤，等.原癌基因wip1的研究进展［J］.中国病理学杂志，2008，24（7）：1445－1448.

［15］ Fiscella M，Zhang H，Fan S，et al.Wip1，a novel human protein phosphatase that is induced in response to ionizing radiation in a p53－dependent manner［J］.ProceedingoftheNationalAcademyofSciencesof theUnitedStatesofAmerica，1997，94（12）：6048－6053.

［16］ Krokan H E，Drablos F，Slupphaug G.Uracil in DNA－Occurrence，consequences and repair［J］.Oncogene，2002，21（58）：8935－8948.

［17］ Lu X，Ma O，Nguyen T A，et al.The Wip1phosphatase acts as a gatekeeper in the p53－Mdm2autoregulatory loop［J］.CancerCell，2007，12（4）：342－354.

［18］ Lu X，Nannenga B，Donehower L A.PPM1Ddephosphorylates Chk1and p53and abrogates cell cycle checkpoints［J］.Genes＆Development，2005，19（10）：1162－1174.

［19］ Takekawa M，Maeda T，Saito H.Protein phosphatase 2Calpha inhibits the human stress－responsive p38 and JNK MAPK pathways［J］.TheEMBOJournal，1998，17（16）：4744－4752.

［20］ Yoda A，Xu X Z，Onishi N，et al.Intrinsic kinase activity and SQ／TQ domain of Chk2kinase as well as N－terminal domain of Wip1phosphatase are required for regulation of Chk2by Wip1［J］.TheJournalofBiological Chemistry，2006，281（34）：24847－24862.

［21］ Guevara N V，Kim H S，Antonova E I，et al.The absence of p53accelerates atherosclerosis by increasing cell proliferationinvivo［J］.NatureMedicine，1999，5（3）：335－339.

［22］ Schneider J G，Finck B N，Ren J，et al.ATM－dependent suppression of stress signaling reduces vascular disease in metabolic syndrome［J］.CellMetabolism，2006，4（5）：377－389.

［23］ Shreeram S，Hee W K，Demidov O N，et al.Regulation of ATM／p53－dependent suppression of myc－induced lymphomas by Wip1phosphatase［J］.The JournalofExperimentalMedicine，2006，203（13）：2793－2799.

［24］ Shreeram S，Demidov O N，Hee W K，et al.Wip1 phosphatase modulates ATM－dependent signaling pathways［J］.MolecularCell，2006，23（5）：757－764.

（责任编辑 卢庆萍）

中图分类号：Q78

文献标识码：A

文章编号：1671－7236（2016）12－3094－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.002

收稿日期：2016－06－03

基金项目：国家自然科学基金（31572378）

作者简介：高 倩（1986－），女，山东淄博人，博士生，研究方向：动物细胞工程和基因工程，E－mail：gaoqian36985＠163.com

通信作者：＊牟玉莲（1976－），女，河北保定人，副研究员，硕士生导师，研究方向：动物遗传育种与繁殖，E－mail：mouyulian＠caas.cn

Establishment and Identification of Wip1Over－expressed Transgene Mice Model

GAO Qian，HU Yan－qing，TANG Yi－ting，MU Yu－lian＊（
InstituteofAnimalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China）

Abstract：This study was aimed to build Wip1over－expressed transgene mice，which could provide an animal model for clarifying the pathogenetic mechanism of atherosclerosis，and the transgene mice were screened at RNA level.Mice tissues cDNA were obtained by reverse transcription polymerase chain reaction（RT－PCR），which were used for the next PCR amplification template.The amplified fragments were used for gel recovery.Then，the amplified fragment and empty vector were double enzyme digested.Full－length gene of Wip1，which was obtained by gel recovery，was connected to pcDNA3.1（＋）vector，and the Wip1－pcDNA3.1（＋）over－expressed vector was constructed.Finally，Wip1over－expressed transgene mice were obtained.The transgene mice were identified and screened by Southern blotting and qPCR.30Wip1over－expressed transgene mice were got in this experiment，and the positive mice identified were 11by Southern blotting，the positive rate was 36.67%.Moreover，the positive rate was 32.84%through screening by qPCR.Therefore，the Wip1－pcDNA3.1（＋）over－expressed vector was constructed successfully，and the Wip1over－expressed transgene mice were obtained through identifying and screening at DNA and RNA level of Wip1in mice tissues.

Key words：Wip1；over－expression；mouse model