文│杨明娟（山东省临朐县畜牧局）

抗体的制备、分离和筛选技术

文│杨明娟（山东省临朐县畜牧局）

抗体主要存在于动物的血清中，是机体免疫系统被特定抗原刺激后，宿主体内的B淋巴细胞通过增殖分化以后形成浆细胞所产生的特定免疫球蛋白，它能够特异性地结合特定抗原。在血液和淋巴液中，抗原抗体的特异性结合是宿主抵御外来分子和微生物入侵的一种重要机制。经过多年的实际应用，抗体用于治疗人和动物的传染性疫病的效果日益被认可，其良好的应用前景和筛选技术的革新，推动了抗体的制备、分离和筛选技术的迅速发展。笔者现就相关技术综述如下。

一、人工制备抗体技术

1.多克隆抗体。当一种抗原侵入宿主的体内时，机体便会诱导免疫系统产生可以中和不同抗原决定簇的抗体。一种天然的抗原通常具有多种不同的抗原决定簇，并且每一个抗原决定簇都能够刺激细胞产生一种特异性抗体。如果想要把这些抗体按类进行分离，用目前已有的物理、化学或生化方法几乎不可能做到。

早期制备抗体的放大是将待免疫的动物暴露在抗原条件下，因为抗原物质具有许多不同的抗原决定簇，因此可以产生多种抗体并分泌到血清或者体液中，所以动物血清是包括多种抗体在内的混合物。这种通过体内免疫方法获得的免疫血清称为多克隆抗体，也是第一代抗体。但是这种抗体是混合的，对于感染性疾病的临床治疗和抗体分子功能结构的研究无多大帮助。

2.单克隆抗体。毒素或抗原免疫小鼠等模式动物，可刺激模式动物产生特异性的抗体，但产生抗体的浆细胞是终末状态的细胞，不能增殖分化，因此产生抗体的能力非常有限且存在时间较短。为了能使B细胞在体外或动物体内无限增殖，科学家采用杂交瘤技术，利用骨髓瘤细胞能够无限增殖的特点，将产生特异性抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，得到既能只分泌一种特异性抗体又可以迅速增殖的杂交瘤细胞。然后将其进行体外培养或者注入小鼠体内，就能得到大量针对某一抗原决定簇的单克隆抗体，由此产生了单克隆抗体制备技术。

1995年，美国的芝加哥大学科学家Katherine Knight从转基因的兔中分离出了骨髓瘤细胞，从此创立了兔单克隆抗体的制备技术。兔单克隆抗体比鼠单克隆抗体有更加显著的优势：兔可反复免疫，产生的血清抗体亲和力更高、能够识别更多类型的表位；兔单克隆抗体可以识别出某些小鼠不能识别的抗原；由于兔的脾脏比老鼠大，脾细胞的数量更多，融合试验中产生杂交瘤细胞的数量更多，结合高通量筛选技术能制备更好的抗体。

单克隆抗体用于治疗和诊断疾病的潜力巨大。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有特异性更强、纯度和效价更高、生产成本低等优点，应用前景广阔。单克隆抗体的广泛应用大幅提高了诊断各种恶性肿瘤和传染病的准确性。单克隆抗体技术对各种免疫细胞的分离、鉴定以及分类，各种膜表面分子结构和功能的研究，具有深远的意义。

二、抗体筛选技术

1.噬菌体展示技术。噬菌体展示技术是当前常用的抗体筛选技术，最常用的为溶原性的丝状噬菌体。这项技术在1985年由美国的Smith博士首次提出，首次证实外源DNA可以插入到丝状噬菌体基因Ⅲ中，并与pⅢ蛋白融合展示。噬菌体展示技术是将外源DNA片段插入到噬菌体编码的蛋白基因，使外源基因的表达蛋白可以和噬菌体的外壳蛋白相融合，然后展示在噬菌体的表面。PCR扩增人或动物的抗体库，以单链抗体形式在噬菌体中表达，再以高通量筛选技术进行验证，获得抗体的技术可复制性高，应用广泛。

2.酵母展示技术。酵母（表面）展示技术广泛应用于蛋白质工程领域。该项技术由KD Wittrup实验室建立，是分离和改造抗体特异性、亲和力和稳定性的有力手段。抗体重链和轻链的可变区由linker链接成单链可变区抗体（scFv单链抗体），与酵母表面细胞壁上Aga2p蛋白融合，结合荧光素标记的抗原，以FACS方法分选有结合活性的酵母细胞，然后体外细胞表达抗体，验证抗体的功能。

3.B细胞永生化。B细胞永生化及活化在单克隆抗体制备方案中对于抗体的获得至关重要。前期B淋巴细胞永生化的方法是由EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）来介导转化的，这可以提高细胞的增殖能力和分泌抗体的活性，但缺点是效率低。到2004年，Traggiai等人在研究非典型肺炎冠状病毒的过程中改进提高了EBV转化效率的方法。由于来自人的B淋巴细胞资源有限，很难获得足够的数量，并且因感染原因、程度和阶段的细胞比例不同，所以能够直接分离纯化获得的B淋巴细胞很少，细胞活性低，能够分泌目标抗体的能力也比较低。

目前B淋巴细胞永生化技术已经被广泛应用于单克隆抗体的研究制备和B淋巴细胞的研究。有学者在研究T淋巴细胞、B淋巴细胞的应答过程中也运用了B淋巴细胞永生化技术，并且结合高通量细胞筛选技术，获得了具有较强增殖能力和抗体分泌活性的记忆B淋巴细胞。

4.单细胞PCR技术。近年来开始广泛应用单个B细胞抗体制备技术，该技术是一种体外克隆和表达单个抗原特异性B细胞抗体基因的技术，重链和轻链的可变区的天然配对会被保留，具有需要的细胞量很少、基因多样性好、效率高、全人源等优点。以噬菌体、细菌和酵母展示为代表的抗体库技术可以使用天然免疫库，通过重链、轻链随机重组建立抗体序列，通过与抗原多轮富集筛选亲和力最强的抗体。天然免疫库具有多样性，因此在免疫库中分离天然配对的抗体更具有优势。

单细胞克隆抗体技术主要应用于浆母细胞和记忆性B细胞的克隆。人的浆母细胞表型清楚，以CD3-/CD19+/CD20-/ CD27++/CD38++/IgM-分选感染后急性期或免疫疫苗者7天后的PBMC，半块96孔板（约42个细胞孔，H行作为对照）约能克隆出重轻链匹配抗体20个。这一方法广泛应用于流感疫苗、肺炎球菌疫苗和流感感染者、登革热感染者等突发传染病的B细胞克隆中，通过这种技术，目前已经有研究获得流感、HIV方面研究的中和抗体。另外一种方法是利用特异的抗原蛋白探针，通过组织细胞表达抗原，标记荧光素作为探针分选传染病感染者恢复期的PBMC，从而分选出抗原探针特异性IgG单个B细胞。例如，Adimab公司利用单细胞PCR技术在两个月时间里分离出的埃博拉中和抗体比过去20年埃博拉研究领域分离的埃博拉抗体总和还多。