文|郑美丽（北京市畜牧总站）

猪GPS2基因的克隆及表达分析

文|郑美丽（北京市畜牧总站）

G蛋白途径抑制因子2（G-protein pathway suppressor,GPS2）是近年来新发现的肿瘤抑制因子，是一种多功能蛋白质，参与了多个细胞的进程，能够抑制酵母中由于G-蛋白信号通路持续激活引起的死亡。目前，GPS2基因的研究领域主要分布在人、小鼠等。在人的领域，有最新研究表明GPS2基因调控细胞核中的基因表达。这项研究发现GPS2在细胞膜水平上负调控肿瘤坏死因子-α激活(TNF-α)的信号级联反应中起着至关重要的作用。他们发现增加GPS2的水平会损害细胞对TNF-α的反应，降低炎症反应。鉴于此信息，研究人员分析假如脂肪组织中有更多GPS2的话，是否有助于降低肥胖患者胰岛素抵抗的发展。结果发现，脂肪组织中的胰岛素信号被大大改善。然而在核中过表达的GPS2对肝功能也有负面影响。另外其研究表明GPS2在减轻炎症反应中起着重要的调节功能。这些研究结果揭示了一个针对2型糖尿病和代谢综合征等疾病治疗的潜在的新方向。本实验则是基于实验室前期全基因组关联分析（GWAS）工作，筛选出GPS2基因，针对目前GPS2基因的研究成果，考虑到该基因可能与猪的脂肪沉积有所关联，因而进行初步的基因克隆和序列分析，并研究其在长白猪种的不同组织表达情况差异，从而确定该基因是否对猪的脂肪沉积有确定的规律性影响，为后期的深入工作做探索。

GPS2；基因克隆；序列分析；荧光定量PCR

一、材料与方法

1.实验材料。所选品种为长白猪，样品为中国农业大学动物遗传资源实验室群体样品中随机抽取。选取样品为脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺、肾、脑。

2.实验方法。

（1）RNA的提取和cDNA的合成。利用动物组织总RNA提取试剂盒，分别对长白猪的脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺、肾、脑的样品进行了mRNA的提取，通过NANODROP2000浓度测定仪测定RNA溶液浓度，并检测其提取质量。利用琼脂糖凝胶电泳的方法进一步检测所提取的mRNA溶液的质量。利用提取的mRNA，进行cDNA的合成，试剂盒为第一链合成试剂盒（去基因组）。

（2）CDS区的克隆测序及结构分析。通过PCR克隆测序技术，得到GPS2基因的CDS区，引物序列为：F: TAAGCTAGCGGAGAAAGCGACGAGAAGAC；R: CGAATTCCTGGGAGCGAGGTTGATAGAC；退火温度为58℃。对扩增的产物进行回收，连接转化后，提取质粒，送到测序公司进行测序，从而得到GPS2基因的CDS区序列。然后利用ProtParam（http://web.expasy.org/ protparam/）、Jpred（http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/index.html）、Robetta（http://robetta.bakerlab. org/）等软件及平台，对其进行初步的结构分析。

（3）GPS2基因的表达分析。根据GPS2基因的CDS区序列，设计引物，进行荧光定量PCR实验，引物序列为F：TCAGAGCACCTTCGGCATTT；R: AGCCAGTTTGTTGGTTAGCG；退火温度为60℃，退火时间为10秒，测定GPS2基因在长白猪不同组织的表达情况并分析。

二、实验结果

1.GPS2基因的CDS区序列。本实验通过对GPS2基因进行PCR扩增，所得产物经琼脂糖凝胶电泳检测为单一明亮条带（图1）。将产物回收纯化并连接转化后，测序并将所得到的无载体序列与NCBI上序列比对分析，获得了猪GPS2基因的CDS区准确序列（图2）。

◎图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

◎图2 GPS2基因的CDS区序列测定结果

2.GPS2基因的一级结构分析。ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）软件能检索蛋白质序列理化参数，包括分子质量、理化等电点、氨基酸组成、原子组成、半衰期等，GPS2基因的CDS区所对应氨基酸序列见图3。通过软件分析其一级结构。

3.GPS2基因的二级结构分析。蛋白质的二级结构是指氨基酸残基形成的α螺旋、β折叠、无规则卷曲及模体等组件。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的。各种蛋白质依其一级结构特点在其多肽链的不同区段可形成不同的二级结构。Jpred（http://www. compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/index. html），由Barton Group创建于1998年，应用Jnet神经网络算法，平均准确率达到81%。通过登陆此二级结构预测服务器，分析得到GPS2基因蛋白质的二级结构预测结果，预测该蛋白在21～26、31～77、83～125、128、169～171、236～240、272～276区域可能为α螺旋结构；在129～131、146～151、163～164区域可能为β折叠结构（图4）。

4.GPS2基因的三级结构分析。在一些较小的蛋白质分子中一般只具有单结构域，这时，其三级结构就是它的结构域。在较大的蛋白质分子中，则由两个或者多个相对独立的结构与组合并折叠成在空间上可明显区分的三维结构。Robetta（http:// robetta.bakerlab.org/）是由华盛顿大学baker实验室开放和维护的网络计算平台，用于非商业性的ab initio 和比较建模，提供自动化的蛋白质结构预测结果。通过该平台得到蛋白质三级结构预测结构（图5）。

5.GPS2基因在长白猪不同组织的表达分析。利用实时荧光定量PCR对心、肝、脾、肺、肾、肌肉、腹脂、脑各组织的GPS2基因表达水平进行检测，以目的基因和内标基因的比值作为目的基因的表达量，得到表达结果（图6），发现在长白猪不同组织中，GPS2基因在腹脂中表达量显著高于其他组织。

◎图3 GPS2基因的CDS区所对应的氨基酸序列

◎图4 JalView二级结构图形结果

◎图5 蛋白质三级结构预测结果

◎图6 GPS2基因在各组织中的表达检测

三、讨论

本实验共分为三个部分：GPS2基因的克隆、序列分析及不同组织的表达分析。其中，通过克隆GPS2基因，测得该基因CDS区序列，为序列的分析提供了材料，此外，由于PCR扩增过程中选择了高保真酶，减少了碱基的突变，增加了所得序列的可信度。将所测得的序列与NCBI上查找的猪GPS2基因预测序列比较，相似性达到97%。分析蛋白质的一级结构并预测二级结构和三级结构，从预测结构来看，本研究所克隆的猪GPS2基因的CDS区序列可靠性较高，为进一步研究奠定了基础，实验最后部分对该基因进行了荧光定量PCR，长白猪是优良的外来品种，生长速度快，脂肪沉积能力弱，但繁殖性能低下。因此，试验以长白猪为实验样品，通过荧光定量PCR方法，研究GPS2基因在不同组织间的表达差异性。实验结果显示，GPS2基因在脂肪中的表达量显著高于其他组织，因此初步推断GPS2基因可能与猪的脂肪沉积有一定联系，但由于目前GPS2基因在猪上的研究进展较少，并且，实验目前仍只是局限于分子水平，不具备有力的实验证据，因此，究竟GPS2基因是否与猪脂肪沉积有一定联系，其中具体的机制又是如何，还需后期大量实验的进一步探索。