张力丹 张庆波 杨小静 韦蓉 陈利远 姚新生

“FQ-PCR溶解曲线法”监测麻风患者TCR a链CDR 3谱系漂移的研究

张力丹1张庆波1杨小静1韦蓉1陈利远1姚新生2

麻风病是由麻风杆菌引起的一种慢性接触性传染病。主要侵犯人体皮肤和神经，如果不治疗可引起皮肤、神经等永久性的损害。当下，我国对麻风病的治疗以预防为主，而对于那些已经患上麻风病的患者来说，治疗方法还值得更深层次的研究探索。本篇文章的研究方法是通过T细胞受体a链V区基因各家族CDR 3免疫谱系分析技术来监测麻风患者TCR a链CDR 3谱系的漂移情况，进而初步分析出TRAV家族的CDR 3 PCR产物定量和克隆增生情况，以此为被麻风感染后的患者的T细胞免疫应答变化提供新的研究方向。

CDR 3；FQ-PCR；溶解曲线

T细胞是麻风病发病的重要参与者，其介导的免疫应答在麻风的发生、发展及转归中发挥了关键性的作用[1]。本研究利用FQ-PCR 产物的溶解曲线分析原理，对“FQ-PCR溶解曲线法”监测麻风患者TCR a链CDR3谱系漂移进行研究，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本与试剂

麻风患者外周血10份（由遵义医学院第一附属医院提供），正常健康自愿者外周血4份作为对照。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据Yao XS等[2]中提到的参考文献的合成方法进行实验设计，人体TRAV遗传基因上面存在32条有印物和1条TRAC下游引物，继而生成对照组TRAC上游引物1条，上述所有引物由 Inviogen 上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2 总RNA提取和cDNA合成 根据实验对象总体RNA的提取试剂盒说明书进行实验操作，获得十例麻风病患者DNA提取物和四例健康志愿者的外周血RNA后，根据合成条件，用Oligo dT作为引物扩增cDNA。

1.2.3 FQ-PCR扩增TRAV家族a链CDR3区段PCR扩增 将实验过程中获得的每个样品都做出36个PCR的反应试管，试管编号及实验作用情况如下：第1～34号试验用试管为实验样本试管，第35管为GAPDH对照管，第36管为无引物对照管；对于34个实验样品用试管中均加入cDNA 1μl，上、下游引物各1μl，与此同时用荧光定量Mix 10μl，完成荧光剂定量后用纯水加入至20μl。FQ-PCR扩增反应条件：一是94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃50 s，45个循环；94 ℃ 3 min，一个循环；72 ℃ 10 min，1个循环;二是对实验样品的溶解曲线进行分析：从75～95 ℃以0.2 ℃/s读取一个荧光值，100 cycles；三是FQ-PCR 产物取8 ul，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，剩余样本-20 ℃保存备用。

2 结果

2.1 CD3 FQPCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定

健康志愿者实验数据结果表明，其外周血标本的32个TRAV家族CDR3谱型FQ-PCR产物在1.5%，而麻风病患者的标本样品检测结果显示在预测位置处只有一条带。

2.2 TCR a链CDR3谱型

4例健康者PBMC的32个CDR3谱型的FQ-PCR产物均为多峰图型，无双峰、偏峰、单峰及无峰家族；麻风患者PBMC的32 个TRAV家族CDR3谱型的FQ-PCR产物各家族相对定量表达不一，PBMC的32个TRAV家族CDR3和对照溶解曲线谱型显示，部分TRAV家族表现为双峰、偏峰、单峰图，极少数表达频率极低或消失表现为无峰图。

3 讨论

麻风发病机制复杂，T细胞在抵抗麻风分枝杆菌的免疫反应中作用重要，多项研究证实T细胞的数量及功能决定了细胞免疫的强弱，其与麻风的进程密切相关[3-4]，T细胞TCR CDR3谱系偏向性与麻风的进程显著相关[5]。T淋巴细胞独特的TCR CDR3分子，形成多样性的CDR3基因谱型，它在很大程度上决定了人体血液免疫T细胞的功能特点，实验能够通过对T细胞中特定CDR3序列的测定，能够反映出人体免疫T细胞的增殖情况，进而由此增殖状态推测出其功能水平。

孙永苹等学者在文献研究中指出了TCR CDR3谱系漂移分析技术被广泛应用于感染性疾病、移植、肿瘤和自身免疫病等[6-7]。本研究的实验设计方法是利用溶解曲线与FQ-PCR的方法建立了“FQ-PCR溶解曲线法监测健康志愿者和患者之间的TCR a链CDR3谱系漂移技术”， 在实验过程中对每个患者TRAV家族的CDR3 FQ-PCR产物进行相对定量分析，监测麻风患者外周血样本TCR CDR3的谱系漂移[8-10]。

本文研究分析了10例麻风患者和4例健康者TRAV各家族的CDR3 谱序，结果显示，健康者PBMC的32个TRAV家族溶解曲线图为多峰，而对照组TRAC、GAPDH为单峰，说明CDR3产物存在多样性，提示FQ-PCR产物的多态性可用溶解曲线法进行分析，进而用于研究麻风患者TCR CDR3的谱型特征。而10例麻风患者PBMC的TRAV家族溶解曲线图为单峰和多峰图。本实验的技术和初步数据为进一步研究麻风的应答机制和个体化的抗麻风T 细胞治疗提供了基础。

[1]S Sadhu，BK Khaitan，B Joshi，et al． Reciprocity betw een Regu latory T Cells and Th17 Cells: Relevance to Polarized Immunity in Leprosy[J]． PLoS Negl Trop Dis，2016，10（1）：e0004338．

[2]X Yao，Y Diao，W Sun，et al． Analysis of the CDR 3 length repertoire and the diversity of TCR alpha chain in human peripheral blood T lymphocytes[J]． Cell Mol Immunol，2007，4（3）：215-220．

[3]Saini C，Ramesh V，Nath I． Increase in TGF-β secreting CD4+ CD25+ FOXP3+ T regulatory cells in anergic lepromatous leprosy patients[J]． PLoS Negl Trop Dis，2014，8（1）：e2639．

[4]Bobosha K，W ilson L，van Meijgaarden KE，et al． T-cell regulation in lepromatous leprosy[J]． PLoS Negl Trop Dis，2014，8 （4）：e2773．

[5]W ang X，Golkar L，Uyemura K，et al． T cells bearing V beta 6 T cell receptors in the cell-mediated immune response to Mycobacterium leprae[J]． Journal of Immunology，1993，151（12）：7105-7116．

[6]孙永苹，石彬，朱红倩，等． FQ-PCR溶解曲线技术分析白血病患者PBMC中T细胞TCR仪／βCDR 3谱系特征[J]． 遵义医学院学报，2014，37（1）：39-47．

[7]孙永苹，汤贤英，朱红倩，等． 一例弥漫性大B淋巴细胞瘤组织样本T细胞TCR α/β CDR3谱序的初步分析[J]． 遵义医学院学报，2012，35（2）：98-103．

[8]Maeda Y，Tamura T，Fukutomi Y，et al． A lipopeptide Facilitate induction of Mycobacterium leprae killing in host cells[J]． Pios Negl Trop Dis，2011，5（11）：e1401．

[9]杨丽文，李月红，姚新生． 麻风T细胞应答及TCR CDR 3谱序研究进展[J]． 中国麻风皮肤病杂志，2015，31（6）：347-350．

[10]Kumar S，Naqvi RA，Bhat AA，et al． IL-10 Production from dendritic cells is associated With DC SIGN in humam leprosy[J]．Immunobiology，2013，218（12）：1488-1496．

医学论文中统计分析方法的选择

对于定量资料，应根据所采用的设计类型、资料所具备的条件和分析目的，选用合适的统计分析方法，不应盲目套用t检验和单因素方差分析；对于定性资料，应根据所采用的设计类型、定性变量的性质和频数所具备的条件以及分析目的，选用合适的统计分析方法，不应盲目套用χ2检验。对于回归分析，应结合专业知识和散布图，选用合适的回归类型，不应盲目套用简单直线回归分析，对具有重复实验数据的回归分析资料，不应简单化处理;对于多因素、多指标资料，要在一元分析的基础上，尽可能运用多元统计分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系作出全面、合理的解释和评价。

Study on the FQ—PCR Dissolution Curve Method for M onitoring a TCR Chain CDR3 in Leprosy Patients

ZHANG Lidan1ZHANG Qingbo1YANG Xiaojing1WEI Rong1CHEN Liyuan1YAO Xinsheng21 Department of Dermatology, The Second People’s Hospital of Guiyang City, Guiyang Guizhou 550001, China, 2 Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences of Zunyi Medical College, Zunyi Guizhou 563000, China

Leprosy is a chronic infectious diseasecaused by M ycobacterium leprae. Majorviolations of human skin and nerves, if not treatment can cause permanent damage to the skin, nerves, etc. At present, Chinese treatment of leprosy prevention, and for those patients who have been suffering from leprosy, treatment is also worth studying deeper exploration. The research method of this article is through the T cellreceptor gene drift a chain V region each family CDR3 immune pedigree analysis technique to monitor leprosy patient TCR a chain CDR3 pedigree, and preliminary analysis of CDR3 PCR products and TRAVcloning of quantitative hyperplasia of the family, in order to provide a new research direction for T cell immune response changes after the patients infected with leprosy.

CDR3, FQ-PCR, Dissolution curve

R 440

A

1674-9308（2016）35-0045-02

10．3969/j．issn．1674-9308．2016．35．023

1 贵阳市第二人民医院皮肤科，贵州 贵阳 550001；2 遵义医学院基础医学院免疫学教研室，贵州 遵义 563000