王常婕，靳 卫

（营口职业技术学院，辽宁营口 115000）

农村污水膜生物反应器系统中微生物群落分析

王常婕，靳 卫

（营口职业技术学院，辽宁营口 115000）

近年来，随着农村经济的不断发展，农村污水的排放量不断增加，加之不加限制的灌溉回用最终造成水源污染日益严重，其中，水源中的病原微生物直接影响居民的健康问题，为了有效解决这种问题，采用污水膜生物反应器系统对农村污水中的微生物群落进行了分析，以期对相关研究提供理论依据。

农村；污水膜生物反应器；系统；微生物群落

农村污水中具有大量病原微生物，对这些微生物群落进行细致分析便于细分主要的病原菌，从而为评估水源风险，提出具体解决措施提供数据依据[1]。为了进一步了解该系统的应用价值和应用作用，本文对其具体的应用过程进行了分析，现将研究内容论述如下。

1 材料与方法

1.1 采集样品

图1 污水膜生物反应器系统工艺流程

污水膜生物反应器系统每日的处理量约为600m3。使用聚乙烯容器采集1～5L深层水水样。在水样采集前使用10% 的盐酸浸泡采集容器，然后进行反复冲洗，经由蒸馏水清洗干净后将其置于烘箱中烘干备用。之后将水样保存于4℃环境内，在24h内送检检测其水质参数。接下来，将采集的水样置于4℃的冰盒内，取2L再生水和100mL原污水，使用真空抽滤装置进行过滤，同时低速离心收集其他水样，水样各取 5mL，进行沉淀，最后，对沉淀和滤膜中的物质进行-20℃冰箱存储，以便进行微生物分析。

1.2 使用仪器

DZB-718 便携式多参数分析仪、H165-W高速离心机、ND-2000核酸蛋白测定仪、BOX 凝胶成像系统、BG-Power 600i电泳仪、Strata gene Mx3005P 实时荧光定 量 PCR 仪、电子天平、B5200DT 超声波清洗机等。

1.3 提取基因组的DNA使用无菌剪刀将滤膜剪碎，依照具体步骤用试剂盒提取其总基因组的DNA，具体步骤为将5μL 基因组 DNA 溶液进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，对其浓度进行测定，最后保存在冰箱中，冰箱温度控制在-20℃。

1.4 建立16SrDNA 基因克隆文库

1.4.1 PCR扩增

将基因组 DNA设为模板，使用16SrDNA 基因的通用引物进行PCR扩增，建立50μLPCR 反应体系。体系包括1μL DNA模板、4μLdNTP、5μL 10×PCR buffer、1UTaq DNA 聚合酶，将灭菌后的 ddH2O补充至 50μL。其中，PCR的反应基本条件如下：95℃下预变性10min，而同样温度下变性45s，在55℃时退火处理1min，在72℃时延伸45s，进行循环，次数为35次。于72℃时延伸 10min，进行4℃环境下保持。将PCR扩增形成的物质使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

咸丰十年(1860)，俄国迫使清朝签订《中俄北京条约》，强行规定设在中国境内的卡伦为分界线，指定了中俄西段边界的走向，为更多地割占塔尔巴哈台、伊犁和科布多等领土制造了条约依据。

1.4.2 克隆、转化16SrDNA基因，建立文库

将PCR扩增物质使用仪器进行纯化，将其中的DNA 片段于4℃ 条件下同pGEM-T Easy Vector连接16h，然后导入大肠杆菌 DH5α，置于液体 LB在37℃时进行培养，时间为3h，随后将100μL 在LB平板上进行涂布，培养18h，之后筛选蓝白斑。将其中白色单菌落培养后用载体引物进行 PCR扩增。经由检测后选出阳性克隆子，建立16S rDNA 基因文库。由于细菌较多，所以选取其中的116个阳性克隆子进行扩展，之后进行酶切分型和电泳。接下来，进行EB 染色和蒸馏水漂洗。用成像系统存储结果。对图像结果进行分析，明确ARDRA 的类型的数目，最后，进行测序。

1.4.3 分析基因克隆文库

使用相关网站和软件分析并去除嵌合体，如果核酸相似性大于97%的水平，对操作分类单元（OTU）进行划分[2]。其中，基因文库的多样性覆盖率使用公式进行计算。公式为C=1-n1/N（C代表多样性覆盖率，n1代表一个克隆的 OTU，N表示基因文库的克隆数）。分值越高说明文库的多样性覆盖率越高。而基因文库的序列指数分析使用H和D指数进行计算，H代表Shannon-Wiener 指数，D代表Simpson指数。

1.4.4 建立系统发育树

使用Blast 对NCBI 数据库和测序成功的阳性克隆序列进行同源性检索，通过邻接法建立系统发育树，评估其稳定性，使用非参数支持率计算树的节点。

1.5 分析T-RFLP

对水样基因组DNA进行扩增。其扩增条件为于95℃ 下预变性5分值，同温下变性45s，然后在50℃下退火45s，随后在72℃下延伸 1min后进行循环，次数为30次，之后在同温下延伸10min，进行4℃保持[3]。将两次扩增物质进行混合后纯化，纯化后进行酶切最后对图谱进行分析，依照图谱对微生物的群落结构的多样性进行分析。

1.6 对PCR进行荧光定量

行常规扩增、纯化、载体连接、导入感受态细胞 DH5α、筛选涂板、LB液体培养、提取质粒、测定质粒浓度、检测基因定量。

2 结果与分析

2.1 水质指标及污水处理情况

经检验，总氮、COD、总磷和氨氮去除率分别为20.8%、91.6%、21.8%、97.4%未检出亚硝态氮，其中溶解氧、硝态氮和电导率稳定。在出水中没有检测出蛔虫卵和大肠菌群。其中的粪大肠菌群≤3 个/L。所有出水指标符合《城镇污水处理厂污染物排放标准》。

2.2 基因克隆文库

116个阳性克隆经酶切分型后共有14个OTU能够用来测序，测序成功72个阳性克隆和10个OTU，经检测16S rDNA基因克隆文库中的细菌物种均匀度为 0.81，多样性指数为1.85，这说明污水中优势菌种比例相对较高。就本次研究的克隆文库的覆盖度为 0.988，这说明微生物的种类占全部微生物种类的比例较高。经 OTU 序列BLAST 比对可知，本次研究的细菌的 16S rDNA 基因序列相似性范围为93%～99%。变形菌门、ε-变形菌纲、β-变形菌纲比例为 91.9%、71.1%和20.4%。在此次研究中弓形菌比例较高，这主要源于病原菌生长适应性强所致。此外，未培养细菌、厚壁菌门、拟杆菌门比例为4.11%、2.71%和1.41%，这说明农村污水中细菌较为多样性。

2.3 T-RFLP 结果

分析细菌群落的T-RFLP 图谱，其中，好氧池、调节池、膜生物反应池中的群落结构稳定，T-RFs 片段数量较多。这三个系统中调节池中的 Shannon-Wiener 物种丰度、多样性指数、均匀度最高，这个系统可以为微生物生长提供繁殖条件，具有很好的调节、缓冲作用。在该系统后所有指数均不断递减。

2.4 病原菌定量结果

污水中弓形菌具有一定的优势，经菌属和总数分析可知其扩增效率高达100%，相关系数也均在99% 以上，符合定量要求。

3 结束语

综上所述，农村污水中微生物群落的结构极为复杂，其物种分配均匀、多样性较高，就本次研究结果显示，变形菌门是种类最丰富、数量最多的细菌类群，除此之外还有一系列的多种细菌。经污水膜生物反应器系统处理过后的出水物化指标较高。今后的污水处理不仅要采取污水处理技术，同时还需结合适当的灌溉方式，综合降低水灌溉后病原菌的风险，从而保障农村生态环境。而就本次研究而言，研究内容仍然不够全面，今后笔者将进行深入的研究与分析，旨在进一步提高对微生物群落的认知。

[1] 孔晓，崔丙健，金德才，等.农村污水膜生物反应器系统中微生物群落解析[J].环境科学，2015（9）：3329-3338.

[2] 吴鹏，陆爽君，徐乐中，等.温度对ABR-MBR复合工艺处理生活污水的影响及其微生物群落分析[J].环境科学，2014（9）：3466-3472.

[3] 李军，乔文燕，王朝朝，等.处理垃圾渗滤液复合式膜生物反应器中微生物群落结构的演变和分析[J].北京工业大学学报，2010，37（8）：1111-1117.

Analysis of Microbial Communities in Membrane Bioreactor System of Rural Wastewater

Wang Chang-jie，Jin Wei

In recent years，with the continuous development of rural economy，the discharge of sewage in rural areas is increasing，and the unrestricted irrigation reuse eventually leads to the increasingly serious water pollution，in which the pathogenic microorganisms in water directly affect the health of water users In order to effectively reduce this problem，this paper uses the sewage membrane bioreactor system to analyze the microbial community in the rural sewage，and provide the theoretical basis for the related research.

village；sewage membrane bioreactor；system；microbial community

X172

A

1003–6490（2016）10–0116–02

2016–12–05

王常婕（1980—），女，辽宁营口人，讲师，主要研究方向为环境工程。