李一经，李佳璇，武啸，臧明鑫，谢双羽，姜艳平，崔文，唐丽杰

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

25型蓝舌病病毒VP2蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

李一经，李佳璇，武啸，臧明鑫，谢双羽，姜艳平，崔文，唐丽杰

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

蓝舌病（Bluetongue，BT）为蓝舌病毒（Bluetongue virus，BTV）引起，以高热、白细胞减少、黏膜溃疡性炎症等为主要症状的反刍动物传染病。试验将25型BTV VP2蛋白分段基因分别克隆至pMAL-c5x载体，以终浓度1.0 mmol·L-1IPTG为诱导剂，在大肠杆菌中分别诱导表达带麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的融合蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C。分别以带His标签的重组VP2分段蛋白VP2-A、VP2-B、VP2-C为免疫原，以试验表达VP2分段蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C为抗原筛选杂交瘤细胞。通过细胞融合筛选出6株稳定分泌单克隆抗体的交杂细瘤胞，其中4株McAb亚型鉴定为IgG；2株McAb亚型鉴定为IgM。试验为建立25型BTV血清学鉴别诊断方法奠定基础。

蓝舌病病毒；VP2；原核表达；单克隆抗体

蓝舌病（Bluetongue，BT）由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起，属非接触性传染病，主要感染绵羊和牛等反刍动物，主要症状为高热、白细胞减少、黏膜溃疡性炎症等[1-2]。BTV最早发现于1876年，呈世界性分布。目前已从非洲、欧洲、亚洲、北美、南美和大洋洲国家分离到BTV，分布范围扩大，危害严重。反刍动物感染BTV后平均死亡率为35%，其中易感绵羊死亡率高达80%。世界动物卫生组织将BT规定为需上报疾病，在我国为一类动物疾病。

BTV为呼肠病毒科（Reoviridae）、环状病毒属（Orbivirus）、蓝舌病病毒亚群，是典型环状病毒属病毒。BTV粒子为圆形、无囊膜的二十面立体对称结构，核衣壳直径为53～60 nm，其衣壳外存在一层细绒毛状外层，使总直径提高到70～80 nm。BTV中存在大量基因、抗原变异及多种血清型。目前已确定检测出1～27型BTV，28型BTV和29型BTV正在检测中[3-4]。25型BTV是2008年从瑞士山羊血液样本中分离获得。

BTV分为10个节段，主要编码7种结构蛋白（VP1～VP7）和4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3/ NS3a和NS4）[5-6]。VP2蛋白由L2基因编码，是BTV的型特异性蛋白，由950～960个氨基酸组成，位于病毒外层，各血清型之间氨基酸序列变化范围22.7%～72.9%，各血清型缺乏有效交叉免疫保护[7-8]。VP2主要参与病毒吸附和侵入，与病毒毒力有关。VP2可诱导产生中和抗体，是BTV型特异性抗原主要决定因素[9-12]。25型BTV的VP2与其他血清型病毒VP2同源性仅为23%～79%。因感染25型BTV牲畜无典型症状常被忽略。一旦爆发，发病率和死亡率较高。因此建立针对25型BTV特异性血清学检测方法对BTV防控具有重要意义。

蓝舌病全球暴发有扩大趋势，血清型变异快、种类多，为有效控制其流行，早期诊断很重要。Appleton等首次利用17型BTV高效筛选出21株针对BTV不同结构蛋白及非结构蛋白单克隆抗体[13]。Stewart等通过杆状病毒表达系统构建全新的同时表达蓝舌病内外层蛋白（VP2、VP3、VP5、 VP7）蓝舌病病毒样颗粒，通过动物试验验证该病毒颗粒的免疫原性和保护力，应用前景良好[14]。王凌凤等利用在大肠杆菌表达系统中分段表达17型BTV VP2[15]，将重组蛋白作免疫抗原，以17型BTV病毒粒子作包被抗原制备单克隆抗体，利用噬菌体展示技术分析其抗原表位。

本试验用东北农业大学动物医学学院微生物与免疫学实验室纯化带His标签的VP2-A、VP2-B、VP2-C分别作免疫原，应用pMAL-c5X原核表达系统分段表达、纯化，MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C蛋白作检测抗原，制备单克隆抗体，利用Western blot和ELISA方法鉴定其特异性及稳定性，为后续检测方法建立提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒与菌株

鼠骨髓瘤细胞株SP2/0、大肠杆菌感受态细胞TG1、BL21由东北农业大学动物医学学院微生物与免疫学实验室冻存。表达载体pMAL-c5X由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所张永宁博士惠赠。

1.2 试验动物

SPF级4～6周龄BALB/c小鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.3 主要试剂

特级胎牛血清购自北京瑞京通达生物科技有限公司；IPTG购自北京索来宝公司；青霉素、链霉素购自哈药集团制药六厂；PRMI 1640培养液购自Gibicol公司；HAT（50×）、HT（100×）、二甲基亚砜（DMSO）、融合剂PEG3350、弗氏完全佐剂（FA）和弗氏不完全佐剂（IFA）、辣根过氧化物酶标和荧光FITC标记的山羊抗鼠均购自中杉金桥有限公司；抗体亚类链特异性鉴别试剂盒购自Sigma公司；限制性核酸内切酶、DNA Marker（DL8000）、dNTP mixture、Taq酶均购自宝生物公司；pMAL融合蛋白表达与纯化试剂盒、质粒提取和纯化试剂盒均购自北京中实生物技术有限公司。

1.4 基因重组表达载体构建

图1 L2基因分段扩增结果Fig.1 Result of L2 gene segments

根据GenBank中已登录25型BTV的L2基因序列（EU839840）。利用蛋白分析软件等分析及预测L2基因，将25型L2基因分为A（1～1 206 bp）、B（1 008～1 962 bp）、C（1 812～2 880 bp）3个节段，如图1所示。用Primer 5.0软件，设计PCR扩增引物，如表1所示，MBP25-a、MBP25-b、MBP25-c为针对pMAL-c5x载体引物序列。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence of DNA fragment

PCR反应体系50 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1.5 μL，dNTP 4 μL，rTaqDNA聚合酶1 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 26 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min后进入PCR循环，94℃变性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min。将获得PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收。

将胶回收纯化PCR产物，连入pMD18-Tsimple载体。连接产物用于转化大肠杆菌TG1感受态细胞。取出感受态细胞TG1，冰浴融化后，立即加入10 μL上述连接产物；混匀后冰浴30 min，42℃热激90 s，加入800 μL LB液体培养基，37℃振荡培养1 h，取150 μL涂布氨苄青霉素LB琼脂平板，37℃培养16 h。随机挑取若干单菌落分别接种于含100 mg·L-1氨苄抗性LB液体培养基中，37℃培养过夜后，提取质粒，单双酶切鉴定。

阳性重组质粒鉴定后序列测定。分别将A、B、C片段与表达载体pMAL-5X经BamHⅠ、EcoRⅤ双酶切、EcoRⅠ、NdeⅠ双酶切、EcoRⅠ、NotⅠ双酶切，37℃水浴作用1.5 h，酶切产物经胶回收纯化试剂盒纯化后，经T4DNA连接酶连接。转化E.coliTG1感受态细胞，挑去单菌落，提取质粒，单双酶切鉴定。将阳性重组质粒命名为pMAL-c5X-VP2-A、pMAL-c5X-VP2-B、pMAL-c5X-VP2-C。

1.5 重组VP2蛋白表达与鉴定

将测序正确重组质粒pMAL-c5X-VP2-A、pMAL-c5X-VP2-B、pMAL-c5X-VP2-C热转化至BL21。经单双酶切鉴定后，将含阳性质粒重组菌pMAL-5X-VP2-A/BL21、pMAL-5X-VP2-B/BL21、pMAL-5X-VP2-C/BL21按1∶50接种于含氨苄LB液体培养基中。37℃震荡培养至OD600为0.4～0.6时，加诱导剂IPTG使其终浓度1.0 mmol·L-1诱导表达。将菌体沉淀加入上样缓冲液，表达产物SDSPAGE鉴定。将表达蛋白命名为MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C。

重组菌pMAL-5X-VP2-A/BL21、pMAL-5XVP2-B/BL21、pMAL-5X-VP2-C/BL21大量诱导后，利用GST标签蛋白亲和层析柱纯化。透析袋浓缩。纯化后蛋白使用微量分光光度计测定蛋白浓度，分装后-80℃低温冻存。

纯化后分段蛋白用商品化抗MBP-Tag单抗为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG为二抗，作Western blot鉴定。

1.6 动物免疫及单克隆抗体制备

带His标签的VP2-A、VP2-B、VP2-C蛋白纯化后，分别免疫4～6周龄BALB/C小鼠。间接ELISA法检测小鼠效价。融合免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞，用纯化后MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C作为包被抗原筛选阳性杂交瘤细胞，具体方法如下[16]：用包被缓冲液（0.05 mol·L-1Na2CO3-NaHCO3）稀释纯化的MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C（1 μg·mL-1），每孔100 μL，37℃包被2 h。弃去ELISA板中包被液，加入PBST洗涤3次，每孔200 μL，每次5 min。加入含50 g·L-1脱脂乳PBS作为封闭液，每孔200 μL，37℃封闭2 h。PBST洗涤3次，每孔200 μL，每次5 min。取细胞培养上清100 μL检测间接ELISA效价，并向孔内补加100 μL培养液。同时以SP2/0细胞培养上清作为空白对照，以未免疫小鼠血清为阴性对照，以免疫小鼠血清为阳性对照。37℃孵育2 h。弃去ELISA板中液体，加入PBST洗涤3次，每孔200 μL，每次5 min。以1∶5 000稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG，每孔100 μL，37℃孵育1 h。每孔加入100 μL底物OPD显色液，37℃避光显色15 min。每孔加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4终止反应后，用酶标仪490 nm波长测定OD值。间接ELISA法检测为阳性的细胞孔，有限稀释法亚克隆，经3次亚克隆后获得细胞株筛选结果均为阳性，挑选稳定分泌抗体杂交瘤细胞，将其移至6孔培养板和细胞培养瓶中扩大培养，保存细胞上清，最后冻存细胞。

1.7 单克隆抗体反应性

VP2-A/B/C三段蛋白分别经SDS-PAGE电泳后湿转印，110 V，2 h。结束后将NC膜放入50 g· L-1脱脂乳中4℃封闭过夜，取出NC膜用PBST洗涤3次，每次15 min；以阳性杂交瘤细胞培养上清液为一抗，室温作用2 h，取出NC膜用PBST洗涤3次，每次15 min；再以脱脂乳稀释HRP标记山羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释）为二抗，室温作用2 h，取出NC膜用PBST洗涤3次，每次15 min，作Western blot分析，鉴定单克隆抗体反应性。

1.8 单抗亚类鉴定

用Sigma公司生产单抗亚类鉴定试剂盒测定单克隆抗体亚型，对试剂盒说明书方法稍作修改。方法如下：将试剂盒中IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IGM 6类亚类试剂按1∶1 000用PBS稀释，加入ELISA反应板中，每孔200 μL，37℃作用1 h；PBST洗涤3次，每孔200 μL，每次5 min。每孔加入100 μL杂交瘤细胞培养上清液，室温作用1 h；PBST洗涤3次，每孔200 μL，每次5 min，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG（PBST 1∶2 500稀释），常温作用30 min；PBST洗涤3次，每孔200 μL，每次5 min，OPD显色，37℃避光显色15 min，再加入终止液终止反应，读值。

1.9 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定

将获得的阳性杂交瘤细胞株连续传代培养3个月，收集细胞培养上清液，再将细胞株冻存并复苏，将冻存前后细胞培养上清液以间接ELISA方法检测抗体效价，SP2/0上清为阴性对照，小鼠阳性血清为阳性对照。以此方法评价其分泌抗体稳定性。

1.10 交瘤细胞染色体数鉴定

采用秋水仙素法鉴定染色体数。具体方法如下[16]：选生长旺盛杂交瘤细胞和SP2/0细胞传代培养，48 h后向细胞培养瓶加入终浓度为0.7 μg·mL-1秋水仙素，继续培养5 h后用吸管将细胞吹落转移到离心管中，1 000 r·min-1离心15 min，弃上清；加入37℃预热0.075 mol·L-1KCl溶液5 mL，混匀后37℃水浴作用25 min；细胞悬液中加入新鲜配制固定液（冰醋酸∶甲醇=1∶3）1 mL，混匀后1 000 r·min-1离心15 min，弃上清；加入5 mL固定液使细胞悬浮，轻轻混匀，室温静置40 min，1 000 r· min-1离心15 min，弃上清，重复此步骤；加入固定液5 mL，悬浮并混匀细胞，封好管口，置4℃冰箱过夜；以1 000 r·min-1离心15 min，吸去上清液，保留微量固定液与细胞混匀后滴于预冷玻片，待其自然干燥，Giemsa染色液染色15 min，清水冲洗后放置室温自然干燥。油镜下观察，染色体记数分析。

1.11 单克隆抗体特异性鉴定

利用MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C分别作为反应原，浓度为100 μg·mL-1，每孔100 μL包被ELISA反应板，4℃过夜；5%脱脂乳37℃封闭2 h后，洗涤3次；每孔各加入100 μL单抗上清，每个样品作3个平行孔，同时设置阴性、阳性和空白对照孔，37℃作用2 h，PBST洗涤3次。1∶2 000稀释HRP标记山羊抗鼠IgG，每孔100 μL加入各反应孔，37℃作用1 h，PBST洗涤3次。加入现配制OPD-H2O2底物显色液，100 μL·孔-1，37℃避光显色15 min；加入终止液（2 mol·L-1H2SO4），每孔50 μL，终止显色，读值。

2 结果与分析

2.1 L2基因表达载体构建

将重组质粒pMAL-c5X-VP2-A分别经EcoRⅠ和SalⅠ单双酶切鉴定，1 230 bp出现目的条带；重组质粒pMAL-c5X-VP2-B分别经EcoRⅠ和NdeⅠ单双酶切鉴定，984 bp处出现目的条带；重组质粒pMAL-c5X-VP2-C分别经BamHⅠ和EcoRⅤ单双酶切鉴定，1 155 bp处出现目的条带，3条目的条带均与预期大小一致，结果说明VP2的3个分段基因均已正确插入表达载体pMAL-c5X（见图2）。

图2 重组表达质粒pMAL-c5X-VP2-A、pMAL-c5X-VP2-B、pMAL-c5X-VP2-C酶切鉴定结果Fig.2 Identification of pMAL-c5X-VP2-A,pMAL-c5X-VP2-B,pMAL-c5X-VP2-C by enzyme digestion

2.2 VP2重组蛋白表达及纯化

重组菌pMAL-5X-VP2-A/BL21、pMAL-5XVP2-B/BL21、pMAL-5X-VP2-C/BL21经IPTG诱导后，SDS-PAGE结果显示，均可见预期大小相符融合蛋白，分子质量分别约84、82、82 ku，标签大小分别为40 ku，与预期大小结果相符（见图3）。

重组蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C主要以可溶形式表达，MBP标签试剂盒纯化。Western blot结果表明，重组蛋白在84、82、82 ku处均有特异条带，而空载体重组菌表达对照无此条带（见图4）。重组蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C可被抗Tag-MBP单克隆抗体识别。

2.3 杂交瘤细胞间接ELISA筛选条件

以重组蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C为抗原，小鼠阳性和阴性血清为抗体，采用矩阵法确定抗原和抗体，作10倍稀释为阳性杂交瘤细胞间接ELISA筛选条件。

图3 重组蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C表达鉴定结果Fig.3 Expression of the recombinant protein MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C

图4 重组蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C Western blot鉴定结果Fig.4Western blot of the recombinant protein MBPVP2-A,MBPVP2-B,MBPVP2-C

2.4 单克隆抗体获得及亚型检测

细胞融合后，经3～4次细胞亚克隆，共获6株抗25型BTV的单克隆抗体。其中针对VP2-A、 B、C段蛋白各有两株，命名为25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3、25C-5E5、25C-5G11。经抗体亚类试剂盒鉴定，25A-2C4、25B-1H7、25B-2F3杂交瘤细胞产生抗体均为IgG1，25A-3E9杂交瘤细胞产生抗体为IgG2a，25C-5E5、25C-5G11杂交瘤细胞所产生抗体为IgM，结果如表2所示。

表2 单克隆抗体亚型鉴定Table 2 Monoclonal antibody isotypes identification

2.5 杂交瘤细胞染色体数鉴定

采用秋水仙素法对杂交瘤细胞株和SP2/0细胞染色体计数。染色后油镜观察，挑选细胞形态完整、染色体分散均匀的细胞计数。杂交瘤细胞染色体数目均明显高于SP2/0和脾细胞染色体数目，说明杂交瘤细胞是SP2/0细胞与脾细胞杂交产物。图5给出杂交瘤细胞25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7染色体计数图片，其余略。

图5 杂交瘤细胞株染色体计数Fig.5 Chromosomes number of hybridoma cell strains

2.6 单克隆抗体反应性与稳定性检测

将6株分泌单抗杂交瘤细胞连续体外传代3个月，利用间接ELISA法检测杂交瘤细胞上清和冻存复苏后上清效价。

以重组蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C作为检测抗原，冻存与复苏前后细胞上清为抗体，SP2/0细胞上清为阴性对照。测得6株单抗细胞数值均高于SP2/0对照数值，冻存前后数值无明显差异，判定制备杂交瘤细胞具有良好分泌稳定性。

图625 A-2C4(a)、25A-3E9(b)细胞上清与VP2-A蛋白Western blot鉴定Fig.6 Western blot identification of 25A-2C4(a),25A-3E9(b)with VP2-A protein

通过Western blot试验鉴定单克隆抗体的反应特异性。将原核表达的重组分段VP2蛋白转印至NC膜上，分别以稳定分泌IgG抗体的阳性杂交瘤细胞株25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3培养上清液作一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG作二抗，ECL显色。结果如图6～7所示，在预期位置出现特异性条带，说明制备的单克隆抗体能与重组蛋白特异性结合。

图725 B-1H7、25B-2F3细胞上清与VP2-B蛋白Western blot鉴定Fig.7 Western blot identification of 25B-1H7,25B-2F3 with VP2-B protein

2.7 单克隆抗体特异性检测

25 A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3、25C-5E5、25C-5G11 6株单抗上清分别与MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C间接ELISA反应，结果表明：25A-2C4、25A-3E9只与MBPVP2-A反应，不与MBPVP2-B和MBPVP2-C反应；25B-1H7、25B-2F3只与MBPVP2-B反应，不与MBPVP2-A和MBPVP2-C反应；25C-5E5、25C-5G11只与MBPVP2-C反应，不与MBPVP2-A和MBPVP2-B反应。

3 讨论

目前BTV已有28种个血清型，血清型种类多、变异快，各血清型间缺少交叉免疫保护反应。为解决该问题，本研究主要关注VP2，VP2蛋白为决定BTV型特异性、血凝活性、病毒中和活性的主要抗原。Hwang等利用一株具有中和活性的型特异性单克隆抗体鉴定位于BTV13 VP2上构象表位（aa：642～651）[17]。我国每年进口大量牲畜，为防止25型BTV传入，需获掌握有良好特异性和灵敏度的血清筛选方法。因此通过制备针对BTV25 VP2单克隆抗体建立诊断BTV方法尤为重要。

与细胞繁殖BTV相比，原核表达系统具有周期短、成本低、表达量高、易于规模化等特点，适合于大量繁殖，可用于试验研究。本试验前通过不同表达载体（pET-30a、pET-32a）比较VP2分段蛋白表达量和表达形式差异。结果显示，pMAL-c5X表达蛋白为可溶形式，表达量高。因此，本试验采用实验室已有pET-28a表达的重组蛋白作免疫原，以pMAL-c5X表达的可溶性蛋白作检测抗原制备单克隆抗体。pET-28a表达的重组蛋白VP2-A、VP2-B和VP2-C与其他载体相比具有表达量大、诱导时间短和His标签小等优点；pMAL-c5X表达重组蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B和MBPVP2-C通过低温诱导使重组蛋白以可溶形式存在，蛋白接近天然结构，载体pMAL-c5X上含有麦芽糖结合蛋白（即MBP标签）可在无变性条件下，分别利用MBP纯化试剂盒纯化相应蛋白。

为保持MBPVP2-A、MBPVP2-B和MBPVP2-C抗原性和反应活性并克服蛋白质重折叠问题，优化各种诱导条件。确定用1.0 mmol·L-1IPTG在37℃诱导4 h为MBPVP2-A、MBPVP2-B和MBPVP2-C最佳诱导条件。通过改变诱导时间、温度和诱导剂浓度，获得目的蛋白最大表达量。

本研究共获得6株杂交瘤细胞同25-BTV不同分段的VP2蛋白呈现不同反应特性。6株杂交瘤细胞分别表现不同亚型，由于IgM不适合后期建立检测方法，本试验主要研究分泌IgG抗体的四种杂交瘤细胞，即25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3。

本研究中，通过Western blot试验鉴定单克隆抗体反应特异性，25A-2C4、25A-3E9分别与VP2-A反应，显示25A-2C4、25A-3E9两株细胞VP2蛋白有较强反应性。25B-1H7、25B-2F3分别与VP2-B反应，显示25B-1H7、25B-2F3两株细胞VP2蛋白反应性强。同时，通过间接ELISA反应检测25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3、25C-5E5、25C-5G11 6株与不同分段的25BTV VP2蛋白不发生反应，表明这6株单抗均有良好特异性。

目前普遍认为VP2蛋白是决定BTV血清型主要抗原[18]。本研究通过表达VP2蛋白，制备针对VP2单克隆抗体，为建立25型BTV检测方法提供基础；制备单克隆抗体为建立25型BTV与其他血清型的血清学鉴别诊断方法奠定基础。

4 结论

本研究利用大肠杆菌表达载体表达25型BTV VP2蛋白，重组MBPVP2-A、MBPVP2-B和MBPVP2-C可与商品化的抗Tag-MBP单克隆抗体发生特异性反应，说明该重组蛋白具有良好抗原性。本研究共制备6株针对重组VP2的单克隆抗体，经鉴定，除25C-5E5和25C-5G11为IgM外，其余四株25A-2C4、25A-3E9、25B-1H7、25B-2F3皆为IgG，并且6株单克隆抗体均与VP2蛋白反应。说明本研究制备的单克隆抗体具有良好生物活性和反应活性，可为国内研制25型蓝舌病ELISA诊断试剂盒及有效控制和净化25型蓝舌病奠定基础。

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Prokaryotic expression of VP2 protein of Bluetongue disease virus serotype 25 and preparation of monoclonal antibody/

Bluetongue(BT),caused by Bluetongue virus(BTV),is a ruminant infectious disease that is characterized by hyperpyrexia,leucocyte decrease and mucosal ulcerative inflammation changes.In this study,the gene of serotype 25-BTV VP2 was cloned and segmented into the pMAL-c5x vector,and induced expression the fusion protein MBPVP2-A,MBPVP2-B and MBPVP2-C with the maltose binding protein (MBP)tag by 1.0 mmol·L-1IPTG inducer inE.coliBL21,respectively.VP2-A,VP2-B and VP2-C with His tag, used as immunogen,the VP2 segmented protein MBPVP2-A,MBPVP2-B and MBPVP2-C screen hybridoma cells as antigen.Six hybridoma cells secreting monoclonal antibody steadily screened by cell fusion,among the MAbs against 25-BTV VP2,the isotypes of four MAbs were IgG,and two MAbs were IgM. This study laid a foundation for the establishment of serological methods on differential diagnosis whichcontrasted serotype 25 BTV and other serum types.

bluetongue virus;VP2;prokaryotic expression;monoclonal antibody

S852.65+9.4

A

1005-9369（2016）12-0065-09

时间2016-12-28 10:33:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161228.1033.006.htmlLI Yijing,LI Jiaxuan,WU Xiao,ZANG Mingxin,XIE Shuangyu,JIANG Yanping,CUI Wen,TANG Lijie(School of Veterinary Medicine,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

2016-10-25

“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD12B01）

李一经（1960-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为兽医微生物与免疫学。E-mail:yijingli@163.com

李一经,李佳璇,武啸,等.25型蓝舌病病毒VP2蛋白原核表达及其单克隆抗体制备[J].东北农业大学学报,2016,47(12):65-73.

Li Yijing,Li Jiaxuan,Wu Xiao,et al.Prokaryotic expression of VP2 protein of Bluetongue disease virus serotype 25 and preparation of monoclonal antibody[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(12):65-73.(in Chinese with English abstract)