我国鹅细小病毒免疫学研究进展

2016-02-02杜翔宇李温明胡振林张甜甜胡桂学

中国兽医杂志 2016年7期

关键词：小鹅表位雏鹅

杜翔宇，李温明，胡振林，张甜甜，胡桂学，董　浩

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；2.铁岭出入境检验检疫局，辽宁铁岭 112616；3.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

我国鹅细小病毒免疫学研究进展

杜翔宇1，李温明2，胡振林1，张甜甜1，胡桂学3，董浩1

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；2.铁岭出入境检验检疫局，辽宁铁岭 112616；3.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）是小鹅瘟的病原体，GPV是一种单股的DNA病毒，从分类学角度讲GPV属于细小病毒科，细小病毒亚科。小鹅瘟是由GPV引起的一种高度接触性急性或亚急性败血性的传染病，肠道栓塞为小鹅瘟特征性病变，通过排泄物和代谢分泌物排毒，传播并且扩散到空气环境中，饲料和水极其受到污染，经消化道引起本病迅速传播，小鹅瘟具有较高的死亡率和较强的传染性，7日龄以内的雏鹅非常容易受到感染。小鹅瘟每年在我国不同地区都有不同程度的发生，当在一个区域流行发生后，通常会间隔1-2年或者更长的时间再次发生，流行有一定周期性，疾病暴发后隐性感染的剩余鹅群得到了较强的免疫力，在后期的繁殖过程中将自身的抗体传给雏鹅，从而使雏鹅存在自然被动免疫力。小鹅瘟给养鹅业造成了较大的经济损失，因此受到科研工作者的广泛重视。

目前关于GPV的免疫学方面的研究热点主要包括活疫苗、灭活疫苗及基因工程疫苗的研制、研制与开发单克隆抗体以及抗原表位相关方面的研究。近些年分子生物学和细胞生物学的取得了快速进步，单克隆抗体技术也得到较好的发展，已经在遗传学、免疫学、病毒学和分子生物学等领域受到广泛应用[1-2]。弱毒疫苗株是目前较为常用的小鹅瘟疫苗，对成年鹅和雏鹅并不会产生致病性，但是其保护力较弱、毒力返强、外源病原难以控制以及生产成本高等缺点。基因疫苗为一类带有外源抗原基因的真核重组质粒，在动物体内的宿主细胞中完成转录和翻译过程后，能够表达出相应的抗原蛋白，诱导出具有特异性的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答，从而达到预防和控制疾病的目的[3]。由于大部分天然抗原引发的免疫反应并不能够实现预防感染或预防发病的目的，在表位水平上这就需要做出选择从而改善蛋白质抗原的保护性，进而可以得到更理想的疫苗分子[4]。因此，鹅细小病毒免疫学是研究鹅细小病毒工作的重要组成部分，为更好的防范、控制小鹅瘟，切实为养殖企业带来安全保障具有非常重要意义。

1　鹅细小病毒病原学特征

GPV呈现六角形或者圆形的外观，不存在囊膜，同时也不带有脂类以及糖类，直径大约为20 nm～22 nm，在扫描电镜下GPV以晶格排列，存在着完整的病毒粒子以及病毒空壳。GPV含有相等数目的正、负链DNA的病毒粒子，在提取核酸过程中，正、负极性链十分容易发生退火的现象形成互补的双链DNA。GPV的基因组有LORF以及RORF两个开放阅读框架，2个开放阅读框架之间存在一个18个碱基的片段，LORF编码非结构蛋白（NS1、NS2），RORF编码结构蛋白（VP1、VP2、VP3）。VP2、VP3结构蛋白是其主要免疫功能区，VP3结构蛋白是GPV的主要衣壳蛋白，VP3含有GPV主要抗原决定簇成分，因此VP3基因编码的VP3蛋白在小鹅瘟免疫防治和诊断中起重要作用，是研究基因工程疫苗的首选蛋白[5]。

2　鹅细小病毒免疫学研究进展

2.1弱毒疫苗及基因疫苗的研究目前弱毒疫苗和灭活疫苗是主要用于小鹅瘟预防的疫苗，弱毒疫苗通过母源抗体使雏鹅获得被动免疫的能力，可以诱导雏鹅产生持久的体液免疫，但是诱导雏鹅产生细胞免疫应答能力较弱。胡世君等用鸭胚尿囊液获得的GPV病毒株，通过甲醛进行灭活，以此为抗原，加入矿物油佐剂，得到了油乳剂灭活苗，并且进行了实验室检测和临床检测，得到了很好的免疫保护效果[6]。潘玉民等利用白油作为佐剂，病原为当地分离到的小鹅瘟病毒，制备灭活疫苗，在临床中应用于种鹅，在产蛋前20 d开始肌肉注射，每只1 mL，雏鹅的接种量为0.5 mL/只，接种该疫苗后，攻毒保护率为100%，因此证明该疫苗具有良好的保护效果和免疫原性[7]。陈伯伦等研究利用鸭胚进行弱化小鹅瘟病毒的毒力，而得到的弱毒疫苗，进行免疫种鹅，有95%的雏鹅具有抵抗小鹅瘟的能力，270～300 d内所产的蛋所孵出的雏鹅的免疫保护率为80%，结果说明母鹅所产出的雏鹅具有很好的免疫力[8]。

李琳选用自己分离的具有良好的免疫原性GPV JLDA株浓缩后，按照一定的配比加入白油、乳化剂等作为佐剂，成功地研制了鹅细小油乳剂灭活疫苗，GPV最小免疫剂量为0.25 mL/羽，在4℃的条件下油苗可以完好保存2年，室温的条件下可以保存1个月的时间，物理性状和免疫原性并没有发生改变，符合油乳剂疫苗的标准，用4倍量进行免疫，试验鹅无不良反应[9]。韩新峰将鹅白介素-2和VP3基因进行串联融合表达，还嵌入了一段CpG免疫刺激序列，将获得的3种基因疫苗免疫种鹅，母鹅所产蛋的卵黄抗体和中和抗体规律与所孵化的雏鹅攻毒保护效果呈现一定的正相关性，其中以pcDNA-gIL2-VP3/CpG免疫母鹅所孵出的后代雏鹅的攻毒保护率最高[3]。

2.2单克隆抗体的研制与开发具有高度敏感性以及特异性等的单克隆抗体，在动物疫病的诊断以及治疗过程中有着不可替代的作用，在对GPV的相关研究中，我国许多科研工作者对抗小鹅瘟病毒的抗体进行了一定的探究。李新华以GPV强毒和弱毒为免疫原研制抗体，成功得到2株抗GPV弱毒的单抗和9株抗GPV强毒的单抗，同时还对抗小鹅瘟病毒中和性单克隆抗体进行了研制[10]；郑义民以GPV强毒为免疫原制备了6株单抗，对GPV具有很好的特异性，不能与鸭肝炎病毒等反应[11]；李长瑜利用病毒抗原对6～8周龄小鼠进行4次免疫，然后采用免疫效价较高的小鼠脾细胞与SP/20骨髓瘤细胞进行融合，成功地筛选出来了8株能很好分泌抗GPV单抗，其阳性率大约为10.26%[12]。王娟将纯化得到的GPV液作为制备单克隆抗体的免疫原，对6周龄雌性小鼠进行免疫试验，成功得到3株能稳定分泌抗GPV的单抗的杂交瘤细胞株，实验结果表明，此单克隆抗体能与GPV发生特异性反应，而与DHV、NDV、DPV并不会产生交叉反应[13]。

VP2和VP3是GPV的主要免疫功能区，与VP3存在相同的抗原决定簇，是制备基因工程疫苗的重要的基因。侯秋莲对GPV中国分离株HG5/82毒株的VP2基因进行扩增、构建重组质粒、转化后获得融合蛋白，将纯化的蛋白产物经3次肌肉注射新西兰白兔，制备结构蛋白抗体，采用Western Blot方法对结构蛋白反应原性分析，试验结果表明，所得融合蛋白拥有很好的反应原性[14]。杜秋明利用浓缩的GPV免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术，成功地获得一株抗GPV单克隆抗体杂交瘤细胞株，试验结果表明，杂交瘤细胞株能够特异性的识别GPV尿囊毒和GPV-VP3蛋白，同时而与GST蛋白、GPMV、DHV、DPV无交叉反应，证明杂交瘤细胞株McAb有较好的特异性，杂交瘤细胞株McAb识别的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守区域，杂交瘤细胞株McAb能与GPV-VP3蛋白反应[15]。鹿钟文利用GPV SYG61作为抗原3次免疫小鼠，再取其脾细胞与SP2/ 0细胞进行融合，成功地获得了2株抗GPV的单克隆抗体，通过琼脂扩散试验进一步证明所得到的单抗腹水皆可以与小鹅瘟抗原产生明显的沉淀线，同时都能够与GPV VP3蛋白发生反应，产生特异性的亮绿色荧光[16]。

GPV非结构蛋白NS1是GPV的主要非结构蛋白，对GPV-NS1抗原表位进行研究，不仅有助于我们掌握其抗原结构的功能，在小鹅瘟早期的防治、诊断和病毒的抗原位点功能研究中具有重要的意义。仇铮利用重组质粒pcDNA3.1-GPV-NS1以及纯化重组蛋白GPV-NS1为抗原，对4-6周龄的小鼠进行分组免疫试验，然后将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，间接免疫荧光试验结果表明，其中的4株单克隆抗体能够与pcDNA3.1-GPV-NS1产生强荧光的信号，表明单克隆抗体存在着特异性，同时Western Blot试验结果表明，所获得的单克隆抗体能够与重组NS1非结构蛋白产生特异性反应[17]。

2.3抗原表位的研究研究GPV结构蛋白和非结构蛋白的抗原表位相关内容，一方面有利于发现其抗原结构与功能的关系，另一方面对GPV快速且准确的诊断以及研制并开发安全、高效的基因工程表位疫苗等具有十分重要的意义。李俚利用GPV-VP1重组融合蛋白与不同杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行免疫试验反应，Western Blot试验结果表明，单克隆抗体4B11、5G6、5C11的识别表位存在于GPV-VP1的92aa～123aa内；3A8识别的表位存在于111aa～136aa内；3G4识别的表位限定在111aa～145aa内[18]。郭鹭利用Ni-NTA亲和层析纯化后的GPV VP3重组蛋白作为免疫原，免疫电镜和间接免疫荧光证明4株单抗能够与GPV全病毒结合。通过Western Blot定位出两个抗原表位为430aa～435aa和643aa～647aa[19]。王娟对抗GPV单克隆抗体的抗原表位进行了分析，根据GenBank发表的鹅细小病病毒株全基因序列，采用分段PCR方法对GPVVP3基因进行了扩增，然后成功获得表达重组质粒；将筛选到的4个阳性重组质粒转染COS-1细胞，用间接免疫荧光进行检测显示，在VP3基因的135aa～332aa和322aa～535aa处可以看到在COS-1细胞表而可见特异性荧光，试验结果证实了单克隆抗体的特异性，确定在322aa～332aa处为3E8株单抗的抗原表位部分[2]。于天飞设计了覆盖NS1蛋白C末端453aa～627aa的7个长约30个氨基酸残基的重叠短肽，然后进行融合表达。结果表明，表达的融合蛋白NSb（485aa～514aa）、NSc（498aa～532aa）、NSd （523aa～556aa）、NSe（543aa～573aa）、NSf（564 aa～598aa）和NSg（599aa～627aa）能够被GPV免疫的鹅血清识别[20]。仇铮结合单克隆抗体（MAb）技术对NS1抗原表位进行了鉴定，其中有3株MAb识别的抗原表位均位于485 aa～542 aa，表明485 aa～542 aa这一抗原表位区的抗原性最强[17]。黎明等采用生物学软件对MDPV病毒蛋白的抗原表位进行了预测，并与GPV病毒蛋白抗原表位进行比对，结果表明，相同的表位优势区域能够产生交叉反应，可能存在交叉反应性的区段为321aa～325aa、426aa～430aa、540aa～544aa以及685aa～691aa[21]。李书光通过软件优化分析预测GPV结构蛋白VP3段的抗原表位富集区，并设计引物，原核可溶性表达VP3的抗原表位富集区蛋白，免疫制备的抗血清中和效价能够达到-2.608，以可溶性形式成功表达了GPV结构蛋白VP3优势抗原表位区，且该蛋白作为免疫原具有很好的产生中和抗体的能力[5]。

3　展望

由于GPV本病传播迅速、致死率高，开展GPV免疫相关方面的研究显得尤为重要，常规疫苗对防制小鹅瘟起到了一定作用，但其自身存在不可避免的缺点，虽然如今开展了众多关于GPV保护性基因的克隆和基因工程载体疫苗的构建，GPV核苷酸序列测定已为构建病毒载体和研制基因工程疫苗打下了坚实基础，虽然大多局限于体外的研究，迄今为止GPV的疫苗研制、鉴别诊断、分子流行病学等，有待于进一步研究；研究以及制备抗GPV单克隆抗体，并对抗原表位进行研究，为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法奠定一定基础；由于GPV结构蛋白具有一定特殊性，鉴定的抗原表位可以同时作为VP1、VP2、VP3结构蛋白的共有表位，若为中和表位则可以能够在重组诊断抗原和疫苗研制方面表现出更大的意义，这还需要付出更多的研究工作来进一步验证。

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