杨　威，王春凤

（吉林农业大学动物科学技术学院 吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林 长春 130118）

A型流感病毒非结构蛋白NS1的研究进展

杨威，王春凤

（吉林农业大学动物科学技术学院 吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林 长春 130118）

A型流感病毒是引发人类和其他动物的高度接触性呼吸道感染的一种重要病原体，对公共健康是造成了持续性威胁。由于其分段RNA的快速变化，导致了新的、未知的亚型出现，其中部分亚型可能造成流感大流行，给人类和畜禽造成巨大损失。A型流感病毒属正黏病毒科，血清学上可分为18个血凝素（HA，H1-H18）亚型和11个神经氨酸酶（NA，N1-N11）亚型[1]，其基因组由8个单链负股RNA片段构成，可编码17种不同蛋白质[2]，其中HA，PB1-F2和NS1这3种蛋白对于病毒的毒力发挥具有重要作用。NS1蛋白是一种重要的毒力因子，可以与多种细胞蛋白相互作用，抑制宿主细胞的抗病毒反应。鉴于NS1蛋白的特殊结构和重要功能，当前国内外已将其作为一种流感病毒的治疗靶标，并逐渐将其应用到流感病毒的鉴别诊断及疫苗的研制当中。

1　A型流感病毒非结构蛋白NS1

1.1NS基因及其编码蛋白NS基因位于甲型流感病毒基因组中的第8分段，可编码3种不同的蛋白质，分别为非结构蛋白（NS1）、核输出蛋白（NS2），以及最新发现的流感病毒蛋白（NS3）。NS1蛋白氨基酸序列长度在215～237之间，仅见于感染的细胞中，该蛋白在病毒感染早期大量合成，感染晚期会转移至细胞质中。NS2蛋白也称为核输出蛋白（Nuclear Export Protein，NEP），由不连续阅读框编码的121个氨基酸组成，合成较NS1蛋白晚，主要在病毒感染晚期合成，且在成熟的病毒粒子中少量存在，结构高度保守。NS3蛋白于2012年首次报道，由NS3 mRNA编码的194个氨基酸组成，在感染的细胞中稳定性较好。

1.2NS1蛋白的结构NS1蛋白由两个不同功能的结构域构成，分别为：RNA结合域（RNA-bind⁃ing Domain，RBD）和RNA效应域（Effector Domain，ED），两个结构域由Loop区连接。RBD位于N末端，由3个α螺旋构成，氨基酸序列为1～73，第19～38位氨基酸为核心序列。RBD能形成一种独特的六螺旋二聚体，可与双链RNA（double strand RNA，dsRNA）结合。在与双链RNA结合的氨基酸中，只有R38氨基酸是必需的，但其相邻的氨基酸也发挥一定的作用。ED位于C末端，由7 个β链和3个α螺旋构成，氨基酸序列为85到末端，第134～161位氨基酸为核心序列。ED可以与一些细胞蛋白质结合并使其二聚化，进而加强NS1蛋白与细胞蛋白的相互作用。此外，绝大多数NS1蛋白的RBD含有一个核输出信号，因此，NS1蛋白可以同时在细胞质和细胞核发挥功能。相关学者利用X射线衍射技术发现NS1蛋白并不是简单的二聚体结构。Xu等[3]通过构建α碳的空间填充模型显示出NS1结合域的二聚体位于带状结构上阳性选择的第22到26位点，由于其无序残基上的定位不可用，C末端的残基（第205位及以后）没能显现出来。

2　A型流感病毒非结构蛋白NS1的功能

NS1蛋白的主要作用是抑制宿主免疫应答，尤其是对干扰素产生的抑制和对干扰素诱导产生的蛋白（如双链RNA依赖性蛋白激酶R（Dou⁃ble-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR）和2′，5′-A合成酶（2′-5′oligoadenylate synthetase，OAS）/RNase L）的抗病毒作用的抑制。此外，NS1蛋白也可直接调节病毒复制周期，包括病毒RNA复制，病毒蛋白的合成，并对一般宿主细胞生理指标产生影响等。

2.1在病毒复制转录中的作用NS1蛋白可通过激活和抑制宿主的各种生化途径来与宿主细胞蛋白相互作用，从而有助于病毒更有效的复制，如NS1蛋白可与裂解及腺苷酸化特异因子30 （Cleavage and Polyadeny lation Specificity Protein30，CPSF30）相互作用对mRNA进行剪切，与U6小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）的结合可抑制宿主mRNA剪接。NS1蛋白与真核翻译起始因子 4GI（eukaryotic translation initiation factor 4GI，eIF4GI）和多聚A结合蛋白II[poly（A）binding pro⁃ tein II，PABPII]相互作用来调节病毒蛋白的合成。Yodsheewan等[4]研究发现，NS1蛋白可直接与CPSF30和PABPII结合进而抑制细胞mRNA前体的加工处理、还能和eIF4GI及PABPI相互作用使它们回流到病毒mRNA 5'末端增强病毒的翻译。磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的信号通路对于病毒的复制至关重要，NS1蛋白能与PI3K的调节性亚基P85β相互作用，导致PI3K通路激活，加强病毒的复制。

2.2对宿主免疫系统的抑制作用NS1蛋白主要通过两个方式扰乱宿主的免疫系统：结合RNA阻止细胞因子激活和抑制宿主细胞蛋白的合成。与RNA结合可以防止宿主细胞因子（PKR，RIG-I和2′-5′OAS）的激活，这些宿主细胞因子能识别异常的核糖核苷酸结构，例如双链RNA和病毒ssRNA。NS1蛋白与宿主蛋白相互作用机制是非常复杂的，在干扰素基因转录前或转录后，NS1蛋白可阻止各种干扰素途径的激活，从而防止细胞抗病毒状态的激活。NS1蛋白与TRIM25相互作用导致PKR和RIG-I失活致使干扰素基因预转录发生抑制，从而有效地防止了干扰素转录信号传导的激活。干扰素基因的转录后抑制是通过NS1蛋白与CPSF30和PABP结合，阻止了细胞mRNA的核输出实现的。NS1蛋白能与snRNA结合，阻断mRNA前体的剪切，从而抑制宿主细胞mRNA的核输出。NS1蛋白通过与特定细胞蛋白结合致使细胞内各相关因子功能受阻，进而抑制宿主细胞蛋白的合成。

2.3对干扰素的拮抗作用Yavarian等[5]研究发现，NS1蛋白对IFN-β具有拮抗作用，可使病毒高效复制，由于各型病毒抵制细胞干扰素系统的能力不同，NS1蛋白的作用也存在差异，并因此对病毒的致病性也会造成不同的影响。Maite等[6]研究发现，缺乏NS1蛋白表达的病毒不能在正常细胞中增殖，但在缺乏产生干扰素能力的细胞中却可以存活。John等[7]研究发现，即便是截短NS1的蛋白，仍然可以诱导高强度的干扰素拮抗反应。Li 等[8]证实，NS1蛋白主要对宿主细胞的Ⅰ型干扰素系统进行抑制。NS1蛋白还能通过调节相关的基因的表达，干扰树突状细胞（DC）的成熟和迁移，使树突状细胞（DC）无法刺激Th1细胞分泌IFN-β。此外，并不是每种亚型的NS1蛋白都具有拮抗干扰素的作用，NS1蛋白氨基酸序列中第92位的谷氨酸是决定这种拮抗作用的重要因素，研究发现，第92位谷氨酸的存在有利于病毒对干扰素的抵抗能力及病毒毒力的增强，但是具体机制不详。

2.4调控宿主细胞的凋亡细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，在淋巴组织和淋巴细胞之间具有重要的平衡作用。NS1蛋白可以阻塞，也可以激活细胞凋亡的信号通路，通过这种双重作用对细胞凋亡进行调节，以确保病毒高效的复制。

2.4.1抑制细胞凋亡Zhang[9]等研究显示，H3N2型猪流感病毒中的NS1蛋白可通过调控宿主反应来拮抗MAVS介导的细胞凋亡。Sasaki等[10]研究表明，相对于野生型（WT）病毒，MFPTr病毒能通过抑制Akt磷酸化来抑制caspase-3和PARP-1的裂解进而抑制细胞凋亡的诱导。David等[11]研究发现，在感染野生型病毒的MRC-5或A549细胞中，NS1蛋白的组成型表达不能阻止因细胞凋亡引起细胞死亡，表明NS1并不直接抗凋亡。Atsu⁃shi等[12]研究表明，NS1蛋白可通过抑制JNK信号通路的活化来抑制细胞凋亡。

2.4.2诱导细胞凋亡Luis等[13]研究表明，在病毒感染期间，部分细胞凋亡的诱导与A/NS1蛋白有关，但B/NS1蛋白没有类似的功能。Zhirnov等[14]研究发现，当转染流感病毒的细胞过度增殖时，可促使NS1蛋白诱导细胞凋亡。Zhang等[15]将H5N1型流感病毒的NS1基因与pCMV-Myc载体相连，并转染进A549细胞，发现其表达产物可以诱导细胞发生凋亡。

2.5在流感病毒鉴别诊断中的应用A型流感病毒具有十分广阔的宿主范围，但一些动物感染病毒后，其临床症状不明显，难以区分感染动物和免疫动物。由于NS1蛋白仅存于感染细胞中，所以感染动物体内存在NS1蛋白的特异性抗体，而接种传统疫苗的免疫动物则没有，因此即可区分感染动物和免疫动物。研究发现，用禽流感病毒NS1蛋白作为包被抗原对感染和免疫家禽样品进行ELISA检测，其区分效果较为明显。相关学者通过表达126个氨基酸的NS1蛋白，拯救出了猪流感的弱毒株，对同型和异型毒株的感染都具有抵抗作用，且在感染猪中检测到NS1抗体，因此，可通过检测NS1抗体来确定免疫动物是否感染野毒。

3　展望

A型流感病毒在全球范围内引发严重的公共安全问题，NS1蛋白对其毒力的发挥具有重要作用。随着对NS1蛋白的深入研究，当前已将其作为药物开发的新途径，并已取得阶段性实验成果，如dsRNA-NS1的相互作用，可促使先天免疫功能恢复和病毒复制抑制。NS1蛋白的磷酸化修饰被证明对病毒的复制可能是一种负调控，且不会明显地改变其细胞定位，所以可通过加强对NS1蛋白的磷酸化修饰对病毒的复制进行抑制。目前，NS1缺陷型流感病毒疫苗的试验也取得了良好的效果，研究表明，这种疫苗安全且可诱发显著的抗体水平。鉴于NS1蛋白的结构特性和重要功能，我们相信其在防治流感病毒感染上必将有着广阔的应用前景。

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S852.65文献标志码：A

0529-6005（2016）07-0061-03

2015-09-10

杨威（1990-），男，硕士生，主要从事动物微生态与黏膜免疫的研究，E-mail：648104946@qq.com

王春凤，E-mail：wangchunfeng@jlau.edu.cn