刘一杰，薛永常

（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116000）



植物抗虫基因工程的研究进展

刘一杰，薛永常

（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116000）

摘 要：综述近年来植物抗虫基因研究的主要进展，对植物抗虫基因种类、目的基因来源及其编码蛋白的抗虫作用机理进行较为系统的阐述，介绍植物抗虫基因的主要转化方法，针对目前植物抗虫基因研究中存在的主要问题提出相应的解决途径，展望了植物抗虫基因工程的未来发展方向。

关键词：抗虫基因；遗传转化；基因工程

文献著录格式:刘一杰，薛永常.植物抗虫基因工程的研究进展［J］.浙江农业科学，2016，57（6）: 873-878.

近年来，虫害作为我国农林减产的重要原因，越来越受到农林从业者的广泛重视。根据联合国粮农组织统计，全球每年因虫害损失的粮食占世界粮食年总产量的14%左右，严重制约着世界农业经济的发展。农作物虫害除造成大量经济损失外，还会直接导致农产品腐烂、霉变等，甚至产生对人体有毒有害的物质。我国目前治理虫害的主要方法是喷施农药或生物杀虫剂，但此方法不仅造成严重的环境污染，导致害虫的抗药性增强，破坏植被低层生态平衡，而且农产品还会存在对人体有害的大量农药残留。因此，绿色高效的基因工程技术已成为当前植物抗虫研究的重要途径。在提高植物虫害绿色防控技术，推动农药使用量零增长等方面意义重大。

1 抗虫基因种类及来源

1.1 源于微生物的抗虫基因

1.1.1 Bt基因

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiesis，Bt）的毒蛋白基因，简称Bt基因。在芽孢形成时，该基因编码的δ-内毒素（δ-endotoxin），也称杀虫晶体蛋白或晶体毒素，对直翅目、膜翅目、鳞翅目、双翅目、同翅目、鞘翅目和食虫目等多种昆虫以及原生动物、线虫、螨等具有特异性的杀灭作用。杀虫晶体蛋白（130～160 ku）自身没有生物活性，当其被目标昆虫摄食后，在昆虫中肠的碱性环境下被胰蛋白酶水解并激活，形成毒素核心肽段（40～ 70 ku），与昆虫中肠上皮细胞的刷状缘膜上高亲和受体结合，毒素核心肽段部分插入细胞磷脂双分子层，使细胞膜允许离子（Na+，K+等）及寡糖（蔗糖或麦芽糖等）自由通过，影响细胞渗透压，导致细胞裂解死亡，最终灭杀敏感昆虫。

苏云金芽孢杆菌中编码杀虫晶体蛋白的基因称为晶体蛋白质基因，即Cry基因［1］。自1981年首条Cry基因被成功克隆测序以来［2］，截至2015年12月，已报道的Bt基因已经达到813种，其中Cry共775种，分属74个群，Cyt共38种，分属3个群（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil-Crickmore/Bt/toxins2.html）。近几年，对鞘翅目和鳞翅目具有特异性灭杀作用的杀虫晶体蛋白（CryⅤ）以及对线虫具有特异性灭杀作用的杀虫晶体蛋白（CryⅥ）也相继被发现。

1987年，世界上首例Bt转基因抗虫烟草和番茄植株分别培育成功［3-5］。但早期的转Bt基因抗虫植株抗虫性普遍较低，杀虫晶体蛋白的含量只占可溶性蛋白的1/1 000，远远达不到农林业生产种植的要求。1990年Perlak等［6］通过修饰Bt基因，使其在Bt转基因棉花中的表达量大大提高，植株抗虫性明显增强，从而使Bt转基因抗虫技术在农林业中的应用成为可能。到目前为止，Bt基因已经成功转入玉米、水稻、马铃薯、番茄等农作物以及杨树、核桃、苹果等经济林木。我国已开始大面积种植Bt转基因抗虫作物，并在增产增收、降低农药使用量方面获得了显著成效。

1.1.2 营养期杀虫蛋白基因

营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs）是一种新型高效的杀虫毒蛋白。VIPs在苏云金杆菌生长的对数期开始分泌在稳定前期达到最高。目前，VIPs主要由杀虫作用机理不同的VIP1，VIP2和VIP3 3种毒蛋白组成。其中VIP1A分为VIP1A（a）和VIP1A（b）2类，VIP2A分为VIP2A（a）和VIP2A（b）2类。VIP1A（a）与VIP2A（a）构成二元毒素，对鞘翅目叶甲科昆虫有特异性灭杀作用。编码这2种蛋白的基因分别为vip1A和vip2A，约有12%的Bt中存在这2类基因［7］。VIP3A主要包括VIP3A（a），VIP3A（b）和VIP3A（c）。前2种蛋白对鳞翅目昆虫有广谱的灭杀活性，编码蛋白的基因分别为vip3A（a）和vip3A（b）［8-9］。1996年Estruch等［10］发现并成功对vip3A（a）和vip3A（b）2组同源基因克隆测序。目前，VIP1和VIP22种毒蛋白未进行细胞病理学和免疫化学试验，其对敏感昆虫的灭杀作用机理也不了解。而VIP3对敏感昆虫的灭杀作用机理研究已较为深入。通过细胞病理学研究表明，VIP3A蛋白灭杀敏感昆虫的作用机理为VIP3A蛋白特异性的与昆虫中肠内的微绒毛结合，诱发昆虫细胞凋亡，导致细胞核溶解，最终杀灭敏感昆虫，这与杀虫晶体蛋白的作用机理完全不同［11］。2015年余晓娇等［12］报道了BtNBIC-380菌株的vip3A（a）基因在枯草芽孢杆菌中表达的蛋白对棉铃虫具有灭杀活性。

1.1.3 分泌期杀虫蛋白基因

分泌期杀虫蛋白（secreted insecticidal protein，Sip），作为苏云金芽孢杆菌分泌的一种新型的杀虫蛋白，目前对其研究还比较少。对敏感昆虫的灭杀作用机理也没有相关的报道。但作为Bt杀虫毒蛋白的重要组成部分，研究者们已经开始对其进行相关的研究并取得了部分成果。2012年刘艳杰等［13］从编号为QZL26的Bt野生菌株中成功克隆得到1 038 bp的碱基序列，生物信息学分析表明，其编码的345个氨基酸与Sip1A氨基酸序列同源性达91.83%。2015年张金波等［14］从编号为DQ89的Bt菌株中成功提取并克隆得到sip基因（1 188 bp），并在大肠杆菌中完成表达。生测结果显示，由该基因编码的蛋白对鞘翅目叶甲科的大猿叶甲具有灭杀活性。针对目前昆虫抗性增强，新型毒蛋白基因的研究意义重大。

1.1.4 源于其他微生物的抗虫基因

异戊烯基转移酶（isopentenyltransferases，IPT）是细胞分裂素合成中的关键酶。将根癌土壤杆菌的IPT基因导入烟草、番茄中表达后，可明显减少烟草夜蛾对植株的损伤。但是，IPT基因的表达会影响植物生长发育。

作为第二代抗虫基因胆固醇氧化酶基因，广泛存在于链霉菌属、红球菌属、假单胞菌属和短杆菌属等细菌中。其编码的胆固醇氧化酶对敏感昆虫有灭杀活性，将其基因导入烟草和番茄后发现，转基因植株可以有效抵御烟草夜蛾的危害［15］。胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的关键酶，其对敏感昆虫的灭杀作用机理是催化分解昆虫体内胆固醇，产生17-酮类固醇与过氧化氢，进而导致昆虫中肠细胞溶胞死亡，最终灭杀昆虫。研究表明，胆固醇氧化酶对棉铃象甲及烟草夜蛾等直翅目、鳞翅目、鞘翅目、同翅目和双翅目的敏感昆虫均有灭杀活性［16］。作为一种宽谱杀虫基因，其可以有效弥补Bt基因抗虫谱的不足。目前，国内对该基因的研究报道较少［17］。

1.2 源于植物的抗虫基因

1.2.1 蛋白酶抑制剂基因

蛋白酶抑制剂（proteaseinhibitor，PI）是一种主要存在于植物块茎、种子等储藏器官中低分子量的多肽或蛋白质。该抑制剂的基因编码区较短，一般没有内含子。PI对植物许多重要的生命活动均有调节作用，经研究发现，其对部分敏感昆虫有灭杀活性。1987年Hilder等［18］首次成功培育了转豇豆蛋白酶抑制剂基因的抗虫烟草植株，使蛋白酶抑制剂基因在植物抗虫基因工程方向应用成为可能。蛋白酶抑制剂基因对敏感昆虫的灭杀作用机理是蛋白酶抑制剂被敏感昆虫侵食后，会与其消化道内的蛋白消化酶结合，抑制其活性，导致昆虫体内蛋白消化酶过量分泌，影响昆虫消化作用，最终导致昆虫死亡。植物蛋白酶抑制剂根据与酶结合的活性位点不同分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和金属羧肽酶蛋白酶抑制剂3类。前2种对敏感昆虫的灭杀作用明显，相比于其他抗虫基因（如Bt基因，凝聚素基因等）具有抗虫谱广、敏感昆虫不易产生耐受性、不污染环境和生物安全性高等优点，因而被广泛研究［19］。

目前蛋白酶抑制剂基因抗虫技术已广泛应用于玉米、棉花等农作物，并取得了较大进展。2015年王江英等［20］成功克隆杜鹃红山茶半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CaCPI）基因转入烟草植株并实现过量表达，研究结果显示，转CaCPI基因的烟草植株对蚜虫的灭杀活性明显提高，接虫5 d后蚜虫累计死亡率达90.75%。

1.2.2 a-淀粉酶抑制剂基因

a-淀粉酶抑制剂基因是一种植物中普遍存在的基因，豆科植物和禾谷类植物的储藏器官中均含有较为丰富的该基因。a-淀粉酶抑制剂基因在植物对抗病虫害侵染的天然防御系统中至关重要［21］。a-淀粉酶抑制剂基因对敏感昆虫的灭杀作用机理是该基因表达的a-淀粉酶抑制剂与敏感昆虫消化道内a-淀粉酶1∶1结合，有效抑制其活性，阻断淀粉的水解反应，使昆虫体内能量供给不足，通过刺激昆虫生理反馈调节系统，导致昆虫体内消化酶过量分泌，产生厌食反应，最终导致昆虫死亡［22］。2009年王晓婧等［23］成功克隆了a-淀粉酶抑制剂基因sai （360 bp）并完成原核表达，实验结果显示，该基因表达的a-淀粉酶抑制剂能有效抑制棉铃虫体内a-淀粉酶活性及其幼虫的生长发育，而对小麦种子内的a-淀粉酶活性没有影响。2015年Bahagiawati等［24］研究了转基因小麦中a-淀粉酶抑制剂与半胱氨酸蛋白酶抑制剂的协同作用可以有效减缓四纹豆象的生长发育。

1.2.3 植物凝聚素基因

植物凝聚素是一种活性蛋白，它具有一个或多个可与单糖或寡糖可逆性结合的非催化结构域，这种结合不会改变糖基的共价结构。研究发现，植物凝聚素对鳞翅目、鞘翅目、双翅目和同翅目等昆虫具有灭杀活性。由于缺乏相关研究，其对昆虫的灭杀作用机理目前尚不明确，一般认为植物凝聚素是通过与昆虫消化道内糖蛋白，如昆虫中肠纹缘膜细胞、围食膜表面或糖基化的消化酶等结合，阻碍昆虫的营养吸收，抑制其生长发育，最终灭杀昆虫。植物凝聚素在植物界广泛分布，植物种子和营养器官中的含量最为丰富。

菜豆凝集素是第一种被报道具有抗虫作用的植物凝集素，但是其对豆象幼虫具有灭杀活性的结论是基于一个错误的实验结果，1991年Huesing等［25］发现这种灭杀活性是由于含有a-淀粉酶抑制剂的缘故。目前，植物凝聚素基因已成功应用于植物抗虫基因领域，如雪花莲凝聚素基因［26］、豌豆凝聚素基因［27］、半夏凝聚素基因［28］和麦胚凝聚素基因等。虽然植物凝聚素基因对敏感昆虫灭杀活性显著，但部分植物凝聚素如麦胚凝聚素对哺乳动物同样存在毒性，而雪花莲凝聚素和豌豆凝聚素对哺乳动物毒性较小，是抗虫基因工程的重点研究方向。目前雪花莲凝聚素已成功转入水稻、马铃薯、葡萄、甘蔗、番茄、油菜、烟草、向日葵等经济作物，均表现出较好的抗虫性［29］。1999年毛雪等［30］通过生测明确鉴定了棉花凝聚素、天南星凝聚素、蓖麻凝聚素以及伴刀豆凝聚素对棉蚜和麦长管蚜的灭杀活性。2015年高勇等［31］对半夏凝聚素结构进行了分析和分子模拟，同年，崔彦芹等［32］成功将半夏凝聚素基因pta导入水稻，并获得相应的转基因阳性植株。

1.2.4 源于植物的其他种类抗虫基因

研究发现植物中提取的核糖体灭活蛋白、几丁质酶、色氨酸脱羟酶、番茄素、过氧化物酶和豌豆脂肪氧化酶、多酚氧化酶、脂氧化酶等都对敏感昆虫有灭杀活性。这几种酶虽然表现出了不同的抗虫效果，但其对敏感昆虫的灭杀机理尚不明确，抗虫谱及生物安全性还有待实验验证。

1.3 源于昆虫自身的抗虫基因

昆虫神经激素是影响昆虫生长、繁殖、变态、代谢和行为等生命活动的重要因素。近几年，研究者已将昆虫神经激素应用到虫害防治中来。但转昆虫神经激素基因抗虫植物的研究还相对较少。1996年姚斌等［33］成功将改造后的昆虫特异性神经毒素AalT基因转入烟草中并表达，获得了对棉铃虫有灭杀活性的抗虫植株。1999年毛利群等［34］成功将昆虫特异性神经毒素基因tox34改造后转入烟草并表达，生测结果显示，该植株对棉铃虫的幼虫有很好的灭杀活性。此外，蝎β型昆虫毒素对部分敏感昆虫有明显的灭杀活性［35］。

2 植物抗虫基因的遗传转化方法

植物基因工程研究过程中，将外源基因导入植物受体细胞，使之发生永久性的定向遗传变异是其关键步骤之一。经过研究者的不断探索，目前发展比较成熟的植物基因遗传转化方法主要有:农杆菌介导法、基因枪法、显微注射法、电击法、聚乙二醇法、花粉管通道法、激光法等多种方法。其中，农杆菌介导法和基因枪法是目前应用最广泛的2种方法。

2.1 农杆菌介导法

农杆菌中存在一种染色体外自主复制的双链环状DNA分子，简称Ti质粒。这段环形双链DNA分子上包含可转移DNA区（T-DNA）、结合转移区、毒性区和复制起始区四部分。其中T-DNA可将外源基因导入植物受体细胞，使其携带的目的基因完成表达，并利用植物细胞全能性，通过组织培养获得完整转基因植株，这种方法叫作农杆菌介导法。此方法利用天然存在的植物基因遗传转化体系，通过基因工程手段达到转基因的目的。农杆菌介导法与其他方法相比具有操作简单、技术成熟、转化效率高、培养周期短、基因沉默现象少、稳定表达性好等诸多优点，此方法还可将大段DNA片段完整转入植物细胞中，因此应用最为广泛。但是此方法也有不足之处，由于T-DNA可以在植物基因的任何区域插入，有可能导致有益基因失活，目前主要用于双子叶植物基因的遗传转化，在禾本科植物方面的应用仍存在诸多局限［36］。

2.2 基因枪法

基因枪法，又称基因枪轰击技术。其原理是将表面附着核酸分子的金属（金、钨等）微粒通过高压喷射导入受体细胞，使外源基因与受体细胞的基因整合表达的过程。这种方法是1987年由康奈尔大学的Sanford等［37］提出的一种直接将外源基因导入受体细胞的物理方法。所用惰性金属微粒不影响植物细胞正常的生理活动。这种方法具有操作简便、无宿主限制、获得转基因植株的周期短、可控性高等优点，因此成为除农杆菌介导法外最为常用的方法。但此方法也有自身的缺点，如转化效率低、容易出现基因沉默和费用较高等。

2.3 聚乙二醇法

聚乙二醇法，也称PEG法。其原理是使用聚乙二醇、多聚-L-鸟氨酸、磷酸钙等高pH值的化学试剂处理去壁的原生质体作为转化受体，通过改变细胞膜通透性使外源DNA分子进入受体细胞完成遗传转化的一种化学方法。这种方法因重复性好、结果较稳定、成本低等优点在发明初期被广泛应用，但此方法由于存在原生质体培养难度大、转化效率低、易受基因型限制等明显的缺点，因此植物抗虫基因工程方面应用较少。

2.4 显微注射法

显微注射法是一种使用显微注射器将遗传物质直接导入受体细胞，再通过组织培养获得转基因植株的方法。此方法具有基因导入准确，克服远缘杂交困难等优点，但由于其操作难度大、工作效率低、表达不稳定等缺点，自基因枪法出现以来，该方法在植物转基因工程方面逐渐被替代，此方法在动物基因工程方面仍被广泛应用。

2.5 电击法与激光法

电击法的原理是在高压电脉冲下，原生质体质膜会出现瞬时可逆的小孔，外源基因可从小孔进入原生质体完成基因转化，通过后期培养获得转基因植株。激光法与电击法相似，原理是用固定波长的激光束聚焦后打在受体细胞表面，引起细胞膜瞬时可逆性穿孔，外源基因从小孔进入受体细胞完成基因转化，经培养后得到完整转基因植株。这2种方法的优点是对受体细胞无毒、受体材料广泛、转化效率高、可用于瞬间表达等。但由于操作复杂，容易对受体细胞造成物理性损伤，因此发展较为缓慢。

2.6 花粉管通道法

花粉管通道法，也称子房注射法，是利用植物有性生殖受精过程中，花粉管形成的从外界到达子房的通道，将外源基因注入胚囊，转化未形成正常细胞壁的卵子、合子或早期胚胎细胞的方法。这种方法免除组织培养的复杂过程，直接获得转化后的植株种子，是一种在活体植株上完成基因转化的新途径。这种外源基因导入技术是由周光宇等［38］建立并发展起来的。目前国内种植面积最广的转基因抗虫棉就是用这种方法培育的。此方法的优点有易操作、可在活体植株上完成基因转化、受体材料广泛等。但其也有一定的缺陷，如转化效率较低，植株受精时间及规律难以控制，外源DNA的结构、浓度及大小对转化结果影响较大等。除此之外，植物基因的遗传转化方法还有很多。在研究过程中，除了选择适合研究对象的单一转化方法外，还可以多种方法结合使用，实现基因转化方法的优缺点互补。

3 存在问题及应对措施

3.1 外源基因的表达量低

一般而言，抗虫基因的表达量与抗虫效果正相关。抗虫基因表达量不高是实验过程中普遍存在的问题［39］。目前减少此问题的方法:选择与受体植物同源性较低的基因，尽量筛选单拷贝个体，避免多拷贝外源基因造成的“基因沉默”现象；采用植物中相应的启动子和增强子构建嵌合基因进行调控；利用基质结合区提高基因表达量；采用叶绿体转化；在载体上嵌入去甲基化基因序列防止甲基化等。

3.2 昆虫抗性增强

昆虫抗性是植物抗虫转基因工程中存在的严重问题，目前抗虫基因已广泛应用于农林业生产中，昆虫抗性问题也随之显现［40］。目前，为了避免或延缓敏感昆虫的抗性，主要有以下几种方法:同时应用2种或多种抗虫基因，不仅可有效提高抗虫性，还可拓宽抗虫谱［41］；选择特异的启动子和损伤诱导启动子，减少杀虫时间，尽量缩短敏感昆虫的适应期［42］；建立避难所等［43］。

3.3 生态风险性

每一种新型转基因抗虫植株的引入，都会对其所处生物群落的结构和功能产生影响。短时间内可能会造成某一物种种群数量的急剧下降，降低生物多样性，破坏生态系统原有的平衡。还有可能引起目标害虫向其他宿主的迁移，对其天敌的种群数量产生影响。如，墨西哥玉米污染事件和Bt转基因玉米对美国黑脉金斑蝶负面影响事件等。此外，转基因植株与其他野生植株杂交，引起基因漂移，可能会产生竞争力更强的有害物种，如加拿大抗除草剂油菜事件。目前，对于转基因植物的生态风险还没有具体的解决办法，我国的生物安全研究也多是从生物技术应用角度出发，因此，建立完备的转基因抗虫植株生态风险防控体系，也是今后转植物抗虫基因工程研究的重要方向。

4 展望

植物抗虫基因工程在30多年的发展历程中已经取得了丰硕的科研成果，转基因抗虫棉花、玉米、水稻、番茄、马铃薯和杨树等在农林业的广泛种植，说明这项技术在逐步走向成熟。探索新型高效的抗虫基因、明确其抗虫机制，增强抗虫基因的遗传表达稳定性，发展新型基因导入技术，采用多种方法避免或减缓敏感昆虫抗性，完善转基因抗虫植株的生态安全保障措施等，将是植物抗虫基因工程未来的发展方向。

虽然目前植物抗虫基因工程各方面还存在诸多问题，但随着新理论、新技术、新方法的不断完善，将会有更多新型优良的抗虫作物从实验室走向大田。在未来的发展中，植物抗虫基因工程必定会在提高植物虫害绿色防控，推动农药使用量零增长等方面做出巨大贡献。

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（责任编辑：张 韵）

中图分类号：Q943.2

文献标志码：A

文章编号：0528-9017（2016）06-0873-06

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160624

收稿日期:2016-01-04

作者简介:刘一杰（1990—），女，河北承德人，硕士研究生，研究方向为分子生物学，E-mail: liuyi-1990@163.com。

通信作者:薛永常（1966—），男，教授，博士，研究方向为分子生物学，E-mail: xueych@dlpu.edu.cn。