燕　飞　朱坚胜

(浙江省台州医院感染科，临海317000)



Toll样受体4与乙型肝炎病毒感染研究进展①

燕飞朱坚胜

(浙江省台州医院感染科，临海317000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重威胁人类健康问题之一，全球约3.5亿慢性HBV携带者，每年大约有60万人死于急性、慢性HBV感染[1]。我国慢性HBV感染者主要来自围产期和婴幼儿时期的感染，由于免疫系统不健全，多数发展为慢性感染，是引起肝硬化、肝癌的主要原因之一[2]。HBV感染后，机体通过细胞毒性T淋巴细胞反应杀死或抑制感染细胞内的病毒复制，控制HBV感染[3]。目前认为机体针对HBV免疫反应不足是导致病毒持续感染的主要原因。机体免疫系统包括固有免疫系统和适应性免疫系统，固有免疫系统在病原微生物侵入时给予最快的防御。模式识别受体(Pathogen recognition receptors，PRR)是参与固有免疫重要的一种结构，识别病原微生物的病原相关模式分子(Pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)和宿主凋亡细胞表面的损伤相关模式分子(Damage-associated molecular pattern，DAMPs) ，并提呈给淋巴细胞，在机体固有免疫和特异性免疫中起重要作用[4]。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)就是PRRs家族中的最重要的一类受体，是哺乳动物和昆虫体内一类进化上保守的病原体识别结构，通过识别细菌、真菌、原生动物和病毒等病原体相关的微生物结构(如糖类、脂类、多肽及核苷酸等)在固有免疫中发挥重要作用[5]。目前已经发现13种哺乳动物TLRs，其中TLR4是在哺乳类中最早发现的TLR，在机体免疫系统中起重要作用[6]。

1TLR4表达、受体及结构

TLR4由一个富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeats，LRRs)结构的胞外域、一个跨膜域和Toll/IL-1受体(Toll/interleukin-1 receptor,TIR)同源结构的胞内域组成[7]，胞外区负责识别不同病原分子，胞内区负责受体活化后的信号转导，激发机体免疫反应。TLR4广泛表达在各种细胞表面，既包括非特异性免疫细胞，比如单核细胞、成熟巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等，也包括特异性免疫细胞T淋巴细胞，B淋巴细胞等[8]。TLR4信号通路不仅可被PAMPs激活，也可被组织损伤和炎症过程中产生的内源性配体激活。外源性配体包括革兰阴性菌产生的脂多糖(Lipopolysacharide，LPS)、真菌的甘露聚糖、结核分枝杆菌的可溶性成分，而内源性配体包括热休克蛋白60、热休克蛋白70、纤维蛋白原等[6]。特异性配体结合TLR4胞外域后，TLR4通过依赖MyD88途径和非依赖MyD88途径两条途径激活下游信号通路[9]。

2TLR4信号通路

1.1MyD88依赖性信号转导TLR4和配体结合后，通过胞内TIR结构域结合MyD88，募集白细胞介素受体相关激酶1和4(IL receptor-associated kinase ，IRAK1和4)，激活肿瘤坏死因子受体活化因子6(Tumor necrosis factor receptor activated factor 6，TRAF6)，形成IRAK-4/IRAK-1/TRAF6复合体，激活IκB激酶(IKK)和丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)，引起丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB激活[10]，调控细胞因子如(IL-1、IL-6、TNF-α、 IL-10、 IL -12等)和其他靶基因的表达[11,12]。

1.2MyD88非依赖性信号转导TLR4胞内结构域可以不结合MyD88，而是通过和含TIR结构域且诱导干扰素-β(IFN-β)(TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFN-β,TRIF)的接头蛋白结合，TRIF激活TBK1和介导的转录因子干扰素调节因子3的磷酸化，激活MAPK和NF-κB[9]，促进下游干扰素等分泌[13]。

3TLR4的免疫调节性与HBV感染

免疫因素在病毒性肝炎的发生和发展过程中起着重要作用。TLR4信号能募集活化自然杀伤细胞和树突状细胞、单核细胞等，通过TLR4对抗原进行捕获、加工处理后提呈给组织相容性复合物Ⅰ、Ⅱ类分子，从而诱导T淋巴细胞分化、增殖，调节机体的免疫反应。有研究表明长期HBV感染者不能激发适当的免疫反应清除病毒导致持续感染[14,15]。John等[16]证实TLR4在感染HBV的肝脏中激活针对HBV的CD8+T 淋巴细胞的免疫反应中起重要作用。有研究发现持续的HBV的感染可以抑制TLR4的表达及功能。慢性HBV感染者外周血单个核细胞的TLR4 mRNA表达明显减少[17,18]，HBV在患者体内复制活跃、病毒载量增高与外周血单个核细胞TLR4 mRNA的表达下调有关[18]。Wei等[19]也发现慢性HBV感染患者肝细胞内TLR4表达下降。阮萍等[20]研究提示枯否细胞的TLR4可能通过影响枯否细胞功能而参与树鼩HBV感染后肝脏病变的慢性化发展过程。Wu等[21,22]将肝细胞和肝脏非实质细胞与HBV转基因小鼠细胞培养上清、HBsAg、HBeAg或者HBV病毒共培养后，调节干扰素分泌的信号通路蛋白干扰素调节因子3(IRF-3)、NF-κB、细胞外调节蛋白激酶(ERK 1/2)表达下降，IFN-β分泌减少，TLR4产生的抗病毒作用消失；提高HBV滴度后，IRF-3表达下降，TNF-α、IL-6分泌减少；通过siRNA抑制HBV复制后，IRF-3、NF-κB、ERK 1/2蛋白表达及炎症因子分泌增加。Heiberg等[23]研究发现使用TLR4特异性配体刺激后，慢性HBV感染者分泌IFN-α较健康者少。可见长期感染HBV的患者TLR4的表达和信号通路受到影响，TLR4在HBV的感染过程中起重要作用。既然HBV抑制了TLR4的表达及功能，如果加入特异性配体激活TLR4后，是否能产生抗HBV的作用呢？进一步研究发现通过加入外源性TLR4的特异性配体，可激活TLR4，并促进下游炎症因子的分泌等免疫功能[21]。同时也有另外一些研究表明TLR4及相应特异性配体可以激活针对HBV的免疫反应。Isogawa等[24]发现，向HBV转基因小鼠静脉注射TLR4特异性的配体，可激活IFN-α/β依赖信号通路抑制HBV的复制。Zhang等[25]发现TLR4配体LPS能激活土拨鼠肝炎病毒感染的肝细胞的 NF-κB,及MAPK,PI-3 k/Akt，使用这些信号通路的阻断剂阻断后，LPS激活的抗病毒效应消失。Zhou等[26]通过临床研究发现在HBV相关性肾炎中较原发性肾小球肾炎肾小管中TLR4表达高，并且和HBsAg分布相似，体外实验将HBV相关性肾炎血清与HK2细胞培养，TLR4表达较健康者增加，加入LPS激活TLR4后，HBV-DNA、HBsAg及HbeAg滴度下降;上调近段胆管上皮细胞TLR4的表达后，乙肝病毒分泌的抗原和HBV-DNA载量下降。此外Lu等[27]发现随着HBV感染患者疾病逐渐进展，树突状细胞的数量逐渐减少，TLR2、TLR4表达明显增加，二者呈正相关，提示外周血中树突状细胞表面TLR2/4协同表达可能促进HBV感染后的疾病进展。Xing等[28]实验证明肝硬化和急性肝衰竭患者单核细胞表面TLR4表达较健康对照组上调。因此,TLR4的激活不仅参与诱导免疫反应的诱导,也参与慢性乙型肝炎并发症的形成。

根据目前的研究可以得出慢性乙肝患者针对HBV的特异性免疫应答减弱，TLR4在慢性乙肝感染患者体内表达下降,HBV可抑制TLR4下游信号通路蛋白的表达及激活，从而影响机体的免疫功能，可能是HBV持续感染的因素之一。目前许多研究转向生物疫苗研究。Farag等[29]在体外将DC负载HBV亚病毒颗粒，TLR4特异性受体LPS体外激活树突状细胞后，导入HBV转基因小鼠后，转基因小鼠体内产生HBV特异性抗体和T细胞反应，虽然HBV抗原水平及病毒载量无明显变化，但可以打破免疫耐受，激活体内免疫反应。但是也有研究发现LPS激活TLR4后导致调节性T细胞表达增多，引起机体对HBV相关抗原的免疫耐受[30]。Chung等[31]使用 TLR4特异性配体(LPS)刺激慢性HBV感染者外周血单核细胞后，分泌细胞因子IL-6及IL-8较健康者无明显变化。是否可通过提高激活TLR4及其信号通路蛋白来增强机体对HBV的免疫反应，寻找治疗HBV慢性感染的靶蛋白，仍需进一步研究，更多使用TLR4受体激动剂作为佐剂的研究可以提高我们对TLR4及其信号通路在抑制HBV的免疫反应中的作用的认识。这些结果的不一致可能与TLR4基因多态性有关。

4TLR4的单核苷酸多态性与HBV感染

TLRs的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)、相关连接分子及细胞因子分泌都可以改变机体免疫反应。在感染HCV的高加索人中发现TLR的单个核苷酸多态性影响疾病的临床转归[32]。TLR4的SNPs 可能影响机体对入侵的病毒、细菌等病原体的免疫反应，人类TLR4的SNP位点大约有100多个，其中T399I 和D299G 位点是TLR4胞外域蛋白中最常见的，这些SNPs可能影响LPS的识别及与其他共刺激分子的连接[33,34]。Cussigh等[35]发现TLR4 rs4986790 A/A是白种人慢性HBV感染者预后不佳的一个影响因素，可能和男性性别相互协同。Wu等[36]发现在中国慢性乙肝患者中，G等位基因携带者TLR4基因rs4986790位点多态性(Asp299Gly)与HBsAg的血清学转换及清除明显相关。Zhou等[37]发现TLR4基因rs11536889位点多态性在肝移植后HBV复发中起重要作用，具有C-C和C-G基因型的肝移植后不易出现HBV感染复发，而C-C基因型的较易出现HBV感染复发。但SNP对HBV急性或慢性感染中的作用仍不清楚，SNP位点对TLR4信号通路激活，包括下游通路的激活、炎症因子的分泌影响还需进一步研究，明确这些单核苷酸多态性对免疫的影响。

5其他

95%的成年人在感染乙型肝炎病毒后，会在几周时间内清除病毒。然而，90%新生儿和1～5岁儿童约30%感染肝炎病毒后却无法清除，并发展成慢性感染，是肝硬化及肝癌的高危因素，可见HBV的感染独特的一个特点就是病毒被清除过程和年龄是密切相关的，但是原因仍不清楚。HBV宫内感染是我国携带者和慢性乙型肝炎发生的传播途径，资捷等[38]体外LPS刺激人类滋养细胞来源的细胞系Bewo细胞，可显著诱导TLR4 mRNA表达及抑制HBV-DNA复制、HBsAg及HBeAg表达，抑制TLR4后可逆转LPS对HBV复制的抑制作用，可见激活TLR4可抑制Bewo细胞中HBV复制。有研究发现LPS体外刺激HBV宫内感染孕妇的脐血单核细胞TLR4表达增强，分泌Th1型细胞因子IFN-γ增加，且TLR4表达与LPS呈正相关，IFN-γ的水平与TLR4表达呈正相关，IL-4水平与TLR4呈负相关，因此LPS可能通过影响TLR4信号传导通路诱导脐血单个核细胞分泌不同细胞因子，选择性调控Th1/Th2型应答[39]。以上研究表明在人类滋养细胞及脐血单核细胞中激活TLR4可抑制HBV-DNA的复制，促进促炎因子的产生，调控Th1/Th2型应答，为阻断宫内HBV感染提供了一个研究方向。

Chou等[40]通过转染HBV小鼠模型发现肠道菌群是年龄影响HBV清除的原因。C3H/HeN成年感染小鼠可快速清除乙肝病毒，但是在相同品系的幼年小鼠无法清除病毒；使用抗生素清除小鼠肠道菌群后，成年小鼠感染HBV后无法快速清除HBV；破坏TLR4信号通路后，成年小鼠和幼年小鼠均能清除HBV，提示肠道菌群可能通过影响激活TLR4信号通路引起免疫耐受，但肠道菌群是否通过促进TLR4分泌IL-10，引起免疫耐受，还是与小鼠基因型有关进而影响HBV的清除，仍需进一步研究。这些研究为探讨乙型肝炎感染的预防和治疗，提供了有益的线索。

6展望

综上所述，TLR4及其信号转导在HBV感染过程中起重要作用，但目前HBV持续感染的具体机制仍不十分清楚，如何打破免疫耐受仍是个难题。因为TLR4在HBV感染者体内不同细胞表面表达变化趋势不同，对相应细胞功能影响不同，如在单核细胞上表达下降，使其抗乙肝病毒作用受到抑制，但在调节性T细胞上却表达上调，增强了调节性T细胞的抑制功能，因此如何靶向调节TLR4及其信号通路的表达都尚不清楚，以及药物调节TLR4信号转导的利弊权衡仍需进一步研究。现在人工合成的TLR4的激动剂可有激活机体的保护性免疫反应，利用TLR4的配体或激动剂可能成为打破HBV患者免疫耐受状态的一种治疗方法。TLR4的单核苷酸多态性对其激活及下游信号通路、炎症因子分泌的影响仍不清楚。这些问题的深入研究对进一步明确HBV慢性感染的免疫机制有重要意义，并可望为HBV感染治疗提供新的思路。

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[收稿2015-05-20修回2015-10-08]

(编辑张晓舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.039

作者简介：燕飞(1985年-)，女，硕士，住院医师，主要从事慢性乙型肝炎发病机制方面的研究，E-mail:yanfeizhanche@sina.com。通讯作者及指导教师：朱坚胜(1965年-)，男，硕士，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事慢性乙型肝炎发病机制方面的研究，E-mail:zhujs@enzemed.com。

中图分类号R392

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0766-04

①本文受浙江省卫生厅基金资助(2010KYB125)。