刘阳阳，冉旭华，闻晓波



轮状病毒拮抗宿主先天性免疫机制研究进展

刘阳阳，冉旭华，闻晓波

轮状病毒(Rotavirus，RV)是世界范围内引起婴幼儿和多种幼龄动物严重肠胃炎的主要病原之一，全世界每年有近50万婴幼儿因感染轮状病毒而死亡。轮状病毒对IFN介导的抗病毒效应敏感，因此，为了拮抗宿主先天性免疫，轮状病毒非结构蛋白1(NSP1)通过作用于IFN表达通路的多个成分，如IFN调节因子家族(IRFs)，转录因子NF-κB，细胞胞质模式识别受体RIG-I等来拮抗宿主先天性免疫。此外轮状病毒NSP2、VP2、VP3和NSP4蛋白也发挥了一定的拮抗作用。本文综述了轮状病毒拮抗机体先天性免疫的相关机制，为轮状病毒的分子生物学研究和疫苗、治疗性药物的研制提供参考。

轮状病毒；NSP1；先天性免疫；干扰素

轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起人类及哺乳动物、禽类等幼龄动物严重脱水性肠胃炎的主要病原体之一。以人轮状病毒为例，在全球范围内，每年有超过50万婴幼儿因RV感染而死亡[1]，85%的病例发生于发展中和欠发达国家和地区。RV感染广泛，与种族和经济状况无关，主要经粪-口途径传播，也可通过直接传播或污染物间接传播[2]。研究表明卫生条件的改善对病毒的传播没有太大的影响，并不能降低发病率和阻止病毒的传播。1969年，Mebus最早从犊牛中发现RV；1973年，澳大利亚科学家Bishop首次报道了该病毒与婴幼儿腹泻有关[3]。Thomas在电子显微镜下观察病毒粒子呈辐射车轮状，故根据其形态特征建议将其命名为轮状病毒，后被国际病毒分类命名委员会采纳。

RV属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，无囊膜，3层蛋白衣壳包绕着11节段的双链核糖核酸(dsRNA)，呈二十面体，直径约为70 nm。RV编码6个结构蛋白(VP1-VP4、VP6、VP7)和6个非结构蛋白(NSP1-NSP6)，除第11节段编码NSP5和NSP6 2个蛋白外，其它节段均分别编码一种蛋白[4]。RV外壳蛋白VP7和VP4分别决定RV的G血清型和P血清型。根据RV的中间层衣壳蛋白VP6的抗原特异性差异，可将至今已发现的RV分为至少A～H 8个群[5]。目前尚无有效的抗RV药物，WHO呼吁将RV疫苗的研制列为优先发展项目之一，以此期望降低RV感染所导致的婴幼儿死亡。阐明RV的致病机制将有助于疫苗研发和抗病药物的创制。

干扰素(IFN)在先天性免疫应答中起到关键性的作用，是机体抵抗病毒感染的第一道防线。I型IFN是先天性免疫过程中主要的细胞因子。RV在与宿主长期的斗争中，进化出多种机制来拮抗宿主先天性免疫应答，包括抑制IFN产生、破坏IFN的信号转导、调节细胞凋亡、逃避宿主识别及抑制细胞自噬等。

1　NSP1与宿主先天性免疫

NSP1是RV拮抗宿主先天性免疫的关键蛋白，是病毒产生的对抗I型IFN的广谱拮抗剂，其从功能上分为RNA结合结构域(aa 1～81)、细胞内定位结构域(aa 82～177)和功能结构域(aa 328～C末端)。C端有一个IRF3(Interferon regulatory factor 3)结合位点，参与IRF3的降解。RNA结合结构域中N端附近还有一个高度保守的锌指结构域(RING，aa 42～79)，其可以与RV的dsRNA结合，推测具有E3泛素连接酶活性，可诱导IRFs和β-TrCP蛋白(β-transducin repeat containing protein)泛素化而被降解。细胞内定位结构域决定了NSP1蛋白在细胞骨架中的聚集位置[6]，而功能结构域可与IRF家族结合[7]。在A群RV中，NSP1是RV中最不保守的，不同毒株间基因片段总长度以及开放阅读框的长度有所不同，推测不同毒株的NSP1蛋白采用不同的策略来拮抗宿主先天性免疫应答。

1.1NSP1与细胞模式识别受体在哺乳动物细胞中存在多种模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，来侦测病原相关分子模式(PAMPs)，如位于细胞表面的Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)、位于细胞质的如视黄酸诱导基因I样受体(retinoic acid-inducible gene I(RIG-I)-like receptors，RLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors，NLRs)、DEXDc螺旋酶受体(DLRs)及DNA模式识别分子-DAI(DNA-dependent activator of interferon-regulatory factors)等。PAMP-PRR相互作用可激活信号转导复合物，诱导IFN表达和感染细胞内早期抗病毒因子的分泌，IFN结合感染细胞自身或邻近未感染细胞的IFN受体从而激活自分泌或旁分泌信号机制，并最终激活JAK-STAT途径，导致大量ISG表达，激活宿主的抗病毒先天性免疫应答。以RIG-I为例，RIG-I可识别病毒基因组的5′-三磷酸基团或负链ssRNA病毒的转录本。另外，5′端三磷酸化的ssRNA(5′-ppp-ssRNA)可作为RIG-I的配体，5′-ppp-RNA加帽或经核苷酸修饰后，则不能被RIG-I识别。这是RIG-I识别宿主细胞自身RNA和病毒RNA的重要机制。RIG-I与病毒PAMP结合后激活下游IFN-β启动刺激因子1(IPS-1，也称作MAVS)，可以激活IKKε/TBK1、IKKα/IKKβ和IKKγ(IKK为IκBs激酶，使IκBs磷酸化后被E3泛素连接酶SCFβ-TrCP降解)，活化IRF3和IRF7，降解IκBs(IκBs为NF-κB结合抑制蛋白)，使IRF3、IRF7和NF-κB活化并组装入核，从而激活转录因子2 (ATF-2)/c-Jun，最终促进IFN-α/β基因的转录，发挥先天性免疫功能[8]。RIG-I的缺失将大大降低IFN-β的产量[9]，损害宿主免疫应答。Qin等通过RV OSU和SA-11株的研究发现，RV NSP1蛋白能够与RIG-I相互作用并介导RIG-I的降解，进而抑制IFN的生成，起到拮抗先天性免疫的作用[10]。这一机制与NSP1的IRF3结合功能无关，但NSP1是直接与RIG-I结合，还是借助于其它因子来实现这一功能尚不清楚。MyD88是宿主先天性免疫的一个重要的信号分子，其能够介导除TLR3外的所有TLRs信号分子，如介导TLR7信号通路诱导I型IFN表达，产生先天性免疫应答，对抗RV感染[11]。TLR3与病毒结合后也能通过IKKε/TBK1使IRF3和IRF7磷酸化而激活I型IFN信号转导通路；TLR5和NOD-like receptor C4 (NLRC4)在细菌鞭毛蛋白刺激下能够介导白细胞介素22(the cytokine interleukin-22，IL-22)和IL-18的分泌表达，从而对抗RV感染[12]，但RV是否已经进化出直接作用于TLRs受体而拮抗宿主先天性免疫应答的功能目前尚无报道，而对其它细胞模式受体也有待进一步研究发现。

1.2NSP1与IRFs转录因子中的干扰素调节因子家族(Interferon regulatory factors，IRFs)在病毒感染后对激活先天性免疫和适应性免疫应答具有重要作用，包括IRF1-IRF9共9个成员。所有IRF蛋白N末端有一个共同的DNA结合结构域(DNA-binding domain，DBD)，而且IRF3、IRF5和IRF7的C近端有一个相似的IRF相关结构域(IRF association domain，IAD)来介导IRF的二聚化。而在C末端有一个自抑制结构域(autoinhibitory domain，ID)与IAD相互作用，使IRF处于抑制状态。ID的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化对IAD产生斥力而脱离，有助于IRF二聚化和随后的核转移。IRF3、IRF5和IRF7对I型IFN和干扰素刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)的表达尤其重要。IRF3、NF-κB和ATF2/c-Jun存在于细胞质中并在病毒感染后被激活；IRF3入核促进ISG的转录，从而促进IFN-β的产生；活化的NF-κB转位到核内与与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录，促进包括IFN在内的炎性细胞因子的转录翻译，产生抗病毒作用。而感染病毒的细胞分泌的IFN-β与未感染病毒的细胞表面的I型IFN受体结合并激活JAK-STAT路径，诱导干扰素刺激基因因子3(ISGF3，由STAT1、STAT2和IRF9构成的异源三聚体)的表达；还可以诱导IRF7的激活，而IRF7为I型IFN产生的主要调节因子，IRF3与IRF7形成异源二聚体入核并促进IFN-α及大量ISGs的转录，诱导先天性免疫应答[13]。而IRF家族的其他成员，如IRF5能够上调I型IFN的表达，促进炎性细胞因子的表达，且在病毒感染后起引发细胞凋亡的作用，对宿主建立抗病毒免疫状态具有重要作用。Graff等对牛RV B641株的研究表明，在感染的早期阶段，其NSP1的锌指结构能够靶向结合IRF3[14]，并诱导蛋白酶介导的IRF3的降解，从而抑制IFN-β的产生，起到拮抗先天性免疫的作用；而对猪RV OSU株的研究显示其也可以抑制IFN-β的表达，但其完整NSP1蛋白仅与IRF3有较弱的相互作用[15-16]，提示不同种属不同毒株间的RV NSP1拮抗宿主先天性免疫的机制可能有所差异。Barro等对RV UK株、BRV和SA11-4F、SA11-5S、SA11-30-19和SA11-30-1A毒株的研究显示，NSP1还可以介导IRF5和IRF7的降解，从而抑制I型IFN的产生，拮抗宿主先天性免疫[17]。Arnold等的研究进一步发现RV SA11-4F毒株NSP1可以特异结合具有IAD区域的IRF3-IRF9，介导蛋白酶体依赖的IRFs的降解，从多方面抑制宿主先天性免疫应答[18]。研究发现人RVs主要通过NSP1诱导IRF5和IRF7的降解来抑制IFN-β的产生，而动物RVs可通过介导IRF3、IRF5和IRF7降解等多种途径来抑制I型IFN的产生[19]，表明RVs已进化出多种机制拮抗宿主先天性免疫应答。

1.3NSP1与β-TrCP蛋白多亚基E3泛素连接酶复合体Skp1/Cul1/F-box中F-box上的底物结合蛋白β-TrCP可与NF-κB抑制蛋白IκB的α亚基结合并使其降解，而IκB-α为NF-κB的结合抑制蛋白，因此通过β-TrCP蛋白通路可激活NF-κB，促进I型IFN产生，引发宿主先天性免疫应答。Ettayebi等对猪RV OSU株和牛RV A5-16株的研究发现，NSP1可以降解β-TrCP，阻止其降解IκB-α，从而抑制NF-κB的激活，减少I型IFN等细胞因子的产生，进而拮抗宿主先天性免疫[20-21]。Fiore等对人RV Wa、K8、DS-1、B37和猪RV CRW-8毒株的研究也得到了相似的结果，RV通过NSP1降解β-TrCP，抑制了NF-κB的活化，进而拮抗宿主先天性免疫应答[22]。Graff等人的研究表明某些RV毒株的NSP1蛋白具有多重功能，能同时降解IRF3和β-TrCP[20]。此前其它任何病毒都没有靶向作用于胞内E3泛素连接酶F-box蛋白并使其降解而拮抗宿主IFN应答的报道，这为病毒与宿主细胞相互作用的机理研究提供了一个研究方向。

1.4NSP1与STAT家族信号转导和转录因子(STAT)家族包括7个成员：STAT1-4、STAT5A、STAT5B以及STAT6，其能够通过相对简单的信号通路把许多细胞因子的信号从细胞膜受体传导到细胞核内，调控细胞生长、分化、凋亡、胚胎发育、器官发生和免疫应答等多种重要的生物学进程。STAT1主要具有抗感染及抑制细胞增殖的作用，参与调节免疫系统、细胞分化、肿瘤抑制、抑制细胞生长以及促进细胞凋亡等生理过程。STAT1能够被IFN-γ/α激活，与STAT2形成二聚体，由核质转运受体蛋白(importin-α)介导入核，诱导ISG的表达，产生级联放大作用，促进更多IFN的产生。Gavan Holloway等对RRV、SA11、Wa和UK株的研究发现，在病毒感染早期NSP1虽然不阻断IFN介导的STAT1的活化，但可能通过降解importin-α，抑制STAT1和STAT2核转位、核聚集等机制阻断IFN下游信号转导通路，从而拮抗宿主先天性免疫应答[23-24]。研究显示某些A群RV对STAT核转移的抑制能力是高度保守的。这些发现表明RV可能进化出通过抑制IFN诱导的STAT信号传导通路而拮抗宿主先天性免疫的新机制。另外STAT需要与DNA结合而避免从核内转移到核外，研究显示RV并没有通过干扰STAT与DNA在核内的结合而促进STAT向核外转移的功能，而是依赖抑制STAT向核内转运的功能。但研究显示NSP1蛋白的C端前47 aa对抑制STAT1/2的核转移是非必需的，且12个恒河猴RV毒株对STAT核转移也无抑制作用[24]。因此对RV通过抑制STAT1/2核转运拮抗宿主先天性免疫的具体分子作用机制和毒株特异性还有待进一步研究。

1.5NSP1与TRAF肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)作为肿瘤坏死因子超家族的适配分子，在被肿瘤坏死因子(TNF-α)激活后，可活化NF-κB激酶(NIK)，NIK再激活IκBs激酶(IKKα/β)，与E3泛素连接酶共同作用降解NF-κB结合抑制蛋白IκBs，通过非经典途径调节下游信号分子NF-κB和激活子蛋白1(AP-1)的激活，诱导宿主免疫应答，在炎症反应、细胞程序性死亡和IFN应答中起到关键性作用。Bagchi等对牛RV野生型A5-13株和NSP1突变型A5-16株的分析显示，NSP1蛋白能通过降解肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)，抑制NF-κB通过非经典途径的活化，进而抑制IFN的产生，调节炎性细胞因子的产生，促进病毒的增殖，逃避宿主先天性免疫反应。其中NSP1-C端部分与TRAF2结合，推测NSP1-N端结构域具有E3泛素连接酶活性，通过蛋白酶体介导的方式来降解TRAF2；而且研究证实NSP1-C端或NSP1-N端单独存在均不能降解TRAF2，其功能的发挥必须依赖于完整的NSP1蛋白[25]。其它一些RV毒株，如SA-11和OSU毒株的NSP1蛋白也可以诱导TRAF2的降解。除RV外的某些病毒，如EB病毒(epstein-barr virus，EBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)也发现了类似的功能[26-27]，推测这可能是RV毒株共同具有的拮抗宿主先天性免疫的一种机制。

1.6NSP1与细胞凋亡细胞感染病毒后，细胞通过早期细胞凋亡来抑制病毒的复制及传播。在RV感染宿主细胞的早期(约2～8 h)，RV NSP1蛋白能够活化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)及下游蛋白激酶B(PI3K/Akt)介导的抗凋亡信号通路，进而激活NF-κB，激活细胞的存活通路来抑制感染细胞的过早凋亡，保证病毒完成复制周期，这也是RV拮抗先天性免疫的策略之一[28-29]。在RIG-I和IRF3通路中激活PI3K能促进IRF3磷酸化和IFN的产生，但RV感染的细胞并未观察到此现象。可能是由于NSP1抑制IFN产生的多重功能抵消了这一作用。Bhowmick等对RV SA-11、A5-16毒株的研究发现，NSP1蛋白还能在感染早期(2～14 h)通过与p53蛋白的DNA结合域作用使其泛素化，并通过蛋白酶体介导的方式降解p53蛋白，抑制下游凋亡基因PUMA和Bax，从而抑制细胞凋亡，且此功能独立于其对IFN和PI3K/AKT途径的调节功能；而在感染后期，病毒需要传播扩散时，NSP1蛋白对p53的作用减弱，导致p53水平升高，诱导细胞凋亡[30]。但现有研究尚未阐明NSP1蛋白通过何种机制来完成此类转换。

2　VP3与OAS/RNase L通路

2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′-oligoadenylate synthetase，OAS)是存在于细胞质内，由IFN诱导产生的一种抗病毒蛋白。病毒dsRNA能够激活OAS，促进2′-5′寡聚腺苷酸产生，而2′-5′寡聚腺苷酸是核糖核酸酶L(RNase L)的激活剂；RNase L则降解病毒和细胞RNAs而限制病毒的复制传播。Liliana等对RRV的最新研究发现，在病毒侵入细胞早期，病毒粒子与细胞相互作用抑制RNase L的活化；之后，当病毒蛋白合成后，VP3的C端结构域(carboxy-terminal domain，CTD)具有2′-5′-磷酸二酯酶活性，其能够降解2′-5′寡腺苷酸，抑制RNase L的活化产生，延迟宿主细胞OAS/RNase L通路的抗病毒作用，拮抗宿主先天性免疫应答[31]，保证病毒的复制。VP3蛋白具有加帽酶活性，可以在RV RNA上添加甲基化的帽子，使得细胞mRNA和RV RNA具有相似的5′端结构，且RV RNA 3′端存在高度保守的poly(A)结构[32]，从而逃避宿主细胞模式识别受体RIG-I等的识别，起到拮抗宿主先天性免疫的作用[33]。

3　NSP2/VP2与病毒RNA自我隔离

RNA病毒在复制过程中产生新的病毒RNA和复制中间体能够激活宿主IFN信号转导，但病毒会利用RNA结合蛋白将RNA包装入子代病毒衣壳或将RNA转运到胞质内特定病毒质(viroplasms)内来隔绝病毒RNA，以此避免宿主细胞PRRs的识别，起到逃避宿主抗病毒免疫应答的目的。RV的dsRNA是在胞质的病毒质中进行包装和复制的。通过siRNA的研究表明，病毒质中的RNA可以免受RNAi的降解[34]。推测是由于RV NSP2和VP2蛋白与病毒RNA结合起到了保护作用[35]，而RV的其它RNA结合蛋白虽然对病毒RNA的亲和力较弱，但也可能对病毒RNA的隔离起到一定帮助作用；再加上VP3蛋白可以在RNA上添加甲基化的帽子，NSP3对宿主RNA的干扰[36]，使RV逃避了RIG-I和MDA5对病毒RNA的识别，延后了宿主的先天性免疫应答。现有数据表明，RV dsRNA是一边合成一边包装入病毒核心中的，避免裸露dsRNA的产生，这种复制策略也干扰了宿主PRRs对病毒RNA的识别，进而逃避宿主的先天性免疫应答。

4　NSP4与细胞自噬

作为先天性免疫的一部分，细胞自噬能够直接吞噬、清除胞内病原微生物。RV具有肠毒素等多功效的NSP4蛋白能与细胞LC3自噬相关蛋白发生融合，抑制细胞自噬[37]；在感染RV的细胞中通过siRNA抑制NSP4表达从而影响了病毒质的形成，而病毒质的形成对RV拮抗先天性免疫能起到一定的作用。当然，其具体作用机制还有待进一步研究。

5　结　语

近年来对病毒如何逃脱宿主免疫反应的相关机制研究越来越受到重视，因为掌握其作用机制具有基于弱化病毒相关逃避策略研制弱毒疫苗的潜在价值，研制靶向作用于免疫系统的特效抗病毒药物的价值。RV作为一种人兽共患病，尤其对婴幼儿和幼畜危害严重，因此对其如何拮抗宿主先天性免疫机制的深入研究具有重要意义。RV NSP1蛋白作为拮抗宿主先天性免疫的关键蛋白，通过调节IRFs、信号转导和转录激活因子、肿瘤坏死因子相关受体因子和β-TrCP蛋白等抑制宿主IFN的信号转导通路；在细胞质中抑制能够特异识别病毒dsRNA的胞质模式识别受体RIG-I，逃避宿主先天性免疫，而其对细胞中其它的PRRs是否具有拮抗作用还有待进一步研究；在感染早期NSP1能够促进NF-κB的激活和抑制肿瘤抑制蛋白p53以延缓感染细胞的凋亡，以利于病毒复制扩增；而在感染后期，则抑制NF-κB等转录因子的活化和减弱对p53的抑制，诱导细胞凋亡，利于病毒传播扩散。如果能够开发可以特异性阻断NSP1蛋白与其靶蛋白相互作用的药物，可以在一定程度上抑制病毒的复制。NSP2/VP2能够与病毒新生RNA结合以阻断细胞受体的识别而逃避抗病毒免疫应答；而VP3蛋白通过给病毒RNA 5′端加帽活化使其逃避宿主免疫识别，通过抑制细胞OAS/RNase L通路保证病毒RNA的复制，延后宿主先天性免疫应答。NSP4蛋白则通过抑制细胞自噬，促进病毒粒子复制和病毒质的形成而发挥作用，对其进一步的研究将有助于今后RV抵抗自噬的机理发展和针对性的药物开发来提高机体的抗病毒能力。通过以上发现的机制的综合作用，RV逃避了宿主的免疫识别而在宿主细胞内生存、复制和扩散，对机体产生致病力。而RV其它蛋白是否对拮抗宿主免疫具有潜在作用还有待进一步研究。通过对RV拮抗宿主先天性免疫的机理研究，对于以后疫苗或免疫佐剂的研究提供了一个方向，为更好地防控RV感染和传播，也为研制抗RV的临床药物及策略提供理论基础。

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Mechanisms of rotaviruses to evade the host innate immunity

LIU Yang-yang, RAN Xu-hua, WEN Xiao-bo

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China)

Rotavirus (RV) is one of the leading pathogens, resulting in severe gastroenteritis in infants and young animals worldwide annually. There are estimated half of million death in infants and young children due to rotavirus infection every year all over the world. Rotaviruses are sensitive to interferon (IFN)-mediated antiviral effects. To counteract these effects, rotavirus encodes a nonstructural protein (NSP1), which induces the degradation of proteins involved in regulating IFN expression by interaction with such like IFN regulatory factor family (IRFs), transcription factor NF-κB and pattern recognition receptor RIG-I and so on. In addition, NSP2, VP2, VP3 and NSP4 protein also play a certain role in antagonizing IFN response. In this review, we mainly focuses on how the rotaviruses evade innate immune defense response during infection in an attempt to take the light on the development of rotavirus vaccines and therapeutic reagents.

rotavirus; NSP1; innate immunity; interferon

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31201909), the National Science Foundation for Post-doctoral Scientists of Heilongjiang Province of China (No. LBH-Q13134) and the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province of China (Nos. QC2013C028, C2015042)

Wen Xiao-bo, Email: wenxiaobo1977@163.com

闻晓波, Email:wenxiaobo1977@163.com

黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319

S858.23

A

1002-2694(2016)07-0659-06

2015-10-30；

2016-04-26

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.014

国家自然科学青年基金项目(No.31201909)；黑龙江博士后科研启动资助项目(No.LBH-Q13134)；黑龙江省自然科学基金(No.QC2013C028, C2015042)