自身启动子调控miR-7真核表达载体的构建及其意义

郭萌萌，廖珍媛，赵娟娟，陶弋婧，胡燕，陈超，秦娜琳，郑静，徐林

(遵义医学院 免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 构建带有miR-7自身启动子的miR-7重组真核表达载体，研究其对人肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法 预测miR-7启动子序列，设计含有该序列和miR-7前体序列目的片段的引物，PCR扩增后亚克隆入pGL3.0-Basic载体以构建miR-7自身启动子调控的真核表达载体pGL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名为p-miR-7-pro)；将所构建载体转染人肺癌95D细胞， Real-time PCR探针法检测95D细胞中miR-7的表达水平；MTT和克隆形成实验分别检测95D细胞的增殖和克隆形成能力；划痕法观察95D细胞体外迁移能力的变化；FACS检测95D细胞的凋亡情况。结果 酶切和测序结果证明成功构建p-miR-7-pro真核表达载体，转染95D细胞后可有效表达miR-7；与对照组相比，p-miR-7-pro转染组95D细胞的体外增殖能力受到明显的抑制(0.60±0.03 vs 0.19±0.05，P<0.05)；同时其迁移能力也显著降低(473±7 vs 99±2，P<0.05)；而细胞凋亡则显著增加(9.233±0.586 % vs 12.967±0.643%，P<0.05)。结论 成功构建由自身启动子调控的miR-7真核表达载体，为后续研究miR-7在肺癌基因治疗中的作用提供重要实验基础。

[关键词]miR-7；真核表达；肺癌；95D细胞；增殖；迁移；凋亡

启动子(Promoter)是一段位于结构基因5′端上游区的DNA序列，是RNA聚合酶特异性识别和结合的部位，控制基因表达的起始时间、转录方向、模板链以及转录效率。启动子的强弱、位点突变以及CpG岛的甲基化，都可能导致基因表达的调控障碍[1-2]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是长约为22个核苷酸的高度保守的单链非编码RNA，它从DNA转录，但不能翻译成蛋白，在转录后水平通过对多重靶基因的负调节参与调控细胞的发育、分化、增殖和凋亡等多种生物学进程[3-4]。miRNAs启动子的活性对于miRNAs的表达具有重要作用[5-6]。……