齐　磊，　段永刚,△，　丁英奇，　张　龙，　刘玉章，　唐晓龙，　伍　骥

(1陕西省中医医院骨科，陕西 西安 710003； 2河北北方学院附属第二医院骨外科，河北 张家口 075100； 3中国人民解放军空军总医院骨科，北京 100142)



Notch-1下调对双氢青蒿素抗人骨肉瘤细胞株U-2OS存活率的影响*

齐磊1，段永刚1,2△，丁英奇2，张龙2，刘玉章2，唐晓龙2，伍骥3

(1陕西省中医医院骨科，陕西 西安 710003；2河北北方学院附属第二医院骨外科，河北 张家口 075100；3中国人民解放军空军总医院骨科，北京 100142)

[摘要]目的： 探讨Notch-1下调对双氢青蒿素抗人骨肉瘤细胞株U-2OS细胞存活率的影响及其作用机制。方法: 双氢青蒿素(5、10、15和20 μmol/L)孵育U-2OS细胞后，采用免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链反应检测骨肉瘤细胞中Notch-1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和Notch-1通路下游基因Hes-1的蛋白和mRNA的表达水平。下调Notch-1表达后，采用MTT法、免疫印迹法和细胞迁移实验检测在双氢青蒿素作用下U-2OS细胞的存活率，MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达以及U-2OS细胞的迁移能力。结果: 免疫印迹法与逆转录聚合酶链反应结果显示双氢青蒿素呈剂量依赖性降低U-2OS细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白和mRNA的表达水平(P<0.05)；下调Notch-1表达后，增强了双氢青蒿素抑制U-2OS细胞生长的作用，MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达及细胞迁移能力进一步降低，显著低于加药组(P<0.05)。结论: 双氢青蒿素可抑制U-2OS细胞中Notch-1通路的活性；下调Notch-1的表达可增强双氢青蒿素抗骨肉瘤的作用。

[关键词]Notch-1； 双氢青蒿素； 人骨肉瘤细胞株U-2OS； 细胞存活率

骨肉瘤是一种多发病于儿童，成人常见，非血液性的恶性肿瘤，尤其在儿童中具有很高的发病率。其显著特点是具有较高的肺转移率(约为 10%～20%)和复发率。目前，骨肉瘤的临床治疗仍存在一定的困难，如化疗药物的毒副作用、耐药性的出现、病情复发及肿瘤细胞转移肺部等。通过化疗或手术治疗后，获得痊愈的患者也很少。随着以手术为主，化疗以及区域性介入化疗为辅，联合放疗、基因、免疫、生物、中药治疗等多程式的治疗方案的出现，使患者5年生存率大大提高，由20%升至60%～70%[1]。研究显示，Notch-1信号通路在肿瘤细胞增殖、分化中起重要作用[2]。有研究报道指出，Notch-1分子在胰腺癌、宫颈癌、结肠癌以及骨肉瘤等多种癌症细胞组织中呈高表达[3-4]，且在骨肉瘤细胞的侵袭转移中发挥关键作用。抑制骨肉瘤细胞中Notch-1信号通路，其侵袭转移能力明显降低[5]。已知基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)与Notch-1信号之间存在相互作用，而Hes-1为Notch-1通路的下游信号分子，在体内外抑制多种细胞的发育分化，Notch-1通路在多种细胞中主要通过Hes-1发挥作用。

青蒿素是一种含过氧基团的倍半萜内酯类化合物，具有多种衍生物[6]。对疟原虫有强大且迅速的杀灭作用，被推荐为以青蒿素为主体的联合治疗，对抗疟疾取得良好的效果。青蒿素类药物被人体吸收后，主要转化为双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)来发挥药理作用。双氢青蒿素以其高效、低毒的抗疟疾作用，除被广泛应用于治疗疟疾外，近十多年来发现双氢青蒿素还具有抗肿瘤、治疗血吸虫病、提高生物体免疫力等功效。已有研究表明双氢青蒿素能有效地抑制人骨肉瘤细胞的增殖和转移侵袭，且能促进其凋亡，能明显地抑制人骨肉瘤细胞生存活力和克隆形成[7]。刘朝霞等[8]研究发现双氢青蒿素能抑制卵巢癌Skov3细胞的增殖，能够下调Skov3细胞中的Notch的表达，其机制可能是通过下调Notch1信号传导实现的。但尚未有双氢青蒿素在骨肉瘤方面的研究报道。本实验通过研究Notch-1通路对双氢青蒿素抗人骨肉瘤细胞株U-2OS细胞的影响，探讨其作用机制。

材料和方法

1材料与试剂

人肉骨瘤U-2OS细胞株购于中国科学院上海生物细胞研究所；RPMI-1640和DMEM培养基购于美国Life Technologies；LipofectamineTM2000，SYBR Green qPCR试剂盒购于Invitrogen；靶向Notch-1基因的2对siRNA寡核苷酸(S1和S2)购于Ambion, S1正义链为5’-GAUUCUGAUUCGCCAACCGATT-3’，反义链5’-UCGGUUGCGAAUCAGAAUCTG -3’；S2正义链为5’-GAUGUAACAUUGACAUUGATT-3’，反义链5’-UCAAUGUCAAUGUUACAUCTC-3’；Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1抗体购于Santa Cruz；双氢青蒿素购于南京泽郎医药科技有限公司；MTT试剂购于Sigma；Transfer小室购于Chemicon；其余试剂均为国产分析纯。

2细胞培养、实验分组及其干预

将人骨肉瘤U-2OS细胞株置于含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的高糖DMEM培养基贴壁培养，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每1～2 d用0.25%胰酶消化传代1次。

本实验按下列两种情况分组：(1)分为空白对照(control，Con)组和不同浓度(5、10、15和20 μmol/L)双氢青蒿素溶液孵育U-2OS细胞24 h组。(2)分5组：空白对照组；DHA组；阴性对照(NC+DHA)组，加入非特异性siRNA；S1+ DHA和S2+ DHA组，分别加入转染了靶向Notch-1基因的两对siRNA序列S1和S2，转染结束后，向除空白组外的细胞中加入15 μmol/L双氢青蒿素溶液分别孵育12 h、24 h、36 h和48 h。

3实验方法

3.1细胞转染按LipofectamineTM2000说明书进行操作。取对数生长期的U-2OS细胞，用0.25%胰酶消化，采用血球计数板技术，加入RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×108/L。取2 mL接种于6孔板，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞融合至70%左右，将2组siRNA溶于无血清RPMI-1640培养基中，加入LipofectamineTM2000，轻轻混合均匀，室温静置30 min，形成复合体后置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，4 h后去掉转染液，改用正常细胞培养液培养24 h。以同样方式转染空载体与非特异性siRNA。

3.2Western blotting法检测相关蛋白表达水平取各组细胞弃去培养液，PBS洗涤3次，提取细胞蛋白并定量。取适量裂解产物，以1∶4比例加入样品与缓冲液，进行SDS-PAGE，电泳完成后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相应 I 抗于4 ℃孵育4 h，TBST洗涤20 min；加入相应 II 抗于室温孵育1 h，TBST洗涤20 min；显色，成像扫描分析系统保存图像。

3.3Real-time PCR检测相关基因mRNA的表达水平按TRIzol说明书提取总RNA，催化逆转录合成cDNA，运用SYBR Green qPCR试剂盒，检测相关基因mRNA表达水平。引物序列见表1。反应条件为 95 ℃ 30 s；60 ℃ 90 s， 64 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 7 min。

表1　引物序列

F: forward; R: reverse.

3.4MTT法检测U-2OS细胞存活率选择处于对数生长期的U-2OS细胞，制备为细胞悬液，接种于96孔板，调整使得密度每孔5×103个，分别于12 h、24 h、36 h和48 h加入MTT溶液，继续培养4 h，吸去培养液，每孔加入DMSO 100 μL，振荡10 min，用酶标仪于488 nm处检测吸光度值，并计算存活率，存活率(%)=(加药孔吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%。

3.5下调Notch-1表达后，检测U-2OS细胞的迁移能力将细胞置于无血清DMEM培养液中培养，稀释浓度为1×108/L；每Transwell小室的上室加入100 μL细胞悬液，下室加入300 μL完全培养基，孵育24 h。生理盐水漂洗，甲醛固定30 min，结晶紫染色，倒置显微镜下拍照，选取3个视野计数。

4统计学处理

全部数据采用SPSS 15.0统计软件进行分析，实验结果采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Bonferroni校正的t检验对两两样本间均数进行比较；以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1双氢青蒿素抑制U-2OS细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达

DHA组中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达降低，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，提示双氢青蒿素能抑制U-2OS细胞中Notch-1信号通路的活性，且其抑制作用具有剂量依赖性，见图1。

Figure 1.The effects of dihydroartemisinin on the protein expression of Notch1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 in U-2OS cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

图1U-2OS细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达

2双氢青蒿素抑制U-2OS细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的mRNA表达

U-2OS细胞经过5、10、15和20 μmol/L双氢青蒿素溶液孵育24 h后，结果显示实验组中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的mRNA表达明显降低(P<0.05)，见表2，结果与免疫印迹法一致，提示双氢青蒿素呈剂量依赖性抑制Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的mRNA表达，表明双氢青蒿素的抗骨肉瘤作用与Notch-1通路有关。

表2U-2OS细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1 mRNA的表达

Table 2.The effects of dihydroartemisinin on the mRNA expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 in U-2OS cells (Mean±SD.n=6)

DHA(μmol/L)Notch-1MMP-2MMP-9Hes-101.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.0050.78±0.05*0.81±0.06*0.83±0.04*0.85±0.05*100.49±0.03*0.42±0.04*0.50±0.03*0.45±0.04*150.22±0.02*0.19±0.02*0.24±0.02*0.18±0.02*200.21±0.02*0.20±0.01*0.23±0.02*0.17±0.02*

*P<0.05vs0 μmol/L.

3MTT法测定U-2OS细胞存活率

下调Notch-1的表达后，15 μmol/L双氢青蒿素溶液孵育U-2OS细胞，并采用MTT法在各时点处检测各组细胞的存活率。结果显示48 h后，DHA组的存活率显著低于空白对照组，而S1与S2转染组的存活率进一步降低(P<0.05)。加药组与阴性对照组间差异没有统计学意义，见图2。这提示下调Notch-1表达可增加双氢青蒿素对U-2OS细胞活力的抑制作用。

Figure 2.Knockdown ofNotch-1 augmented dihydroartemisinin-induced decrease in viability of U-2OS cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDHA group.

图2下调Notch-1的表达对双氢青蒿素抑制U-2OS细胞存活率的影响

4下调Notch-1表达后U-2OS细胞中MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达

在双青蒿素(15 μmol/L)下调MMP-2、MMP-9和Hes-1的基础上，我们进一步下调Notch-1表达，并以15 μmol/L双氢青蒿素溶液孵育细胞24 h后，观察以上蛋白的变化情况。结果发现S1和S2转染组的U-2OS细胞中MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达与DHA组相比显著降低(P<0.05)，而DHA组与阴性对照组间差异没有统计学意义，见图3，提示下调Notch-1表达可进一步降低MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达水平。

Figure 3.Knockdown ofNotch-1 enhanced dihydroartemisinin-induced decrease in the protein expression of MMP-2, MMP-9 and Hes-1 in U-2OS cells. Mean±SD. n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDHA group.

图3下调Notch-1表达对U-2OS细胞中MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白表达的影响

5细胞迁移实验

Transwell迁移实验结果显示，15 μmol/L双氢青蒿素孵育U-2OS细胞24 h后，细胞迁移数明显减少(P<0.05)；在此基础上下调Notch-1表达后，S1和S2转染组中细胞的迁移数与DHA组相比显著减少(P<0.05)。DHA组与阴性对照组相比细胞迁移数间差异无统计学意义，见图4。结果表明下调Notch-1表达能增强双氢青蒿素抑制U-2OS细胞迁移的能力。

Figure 4.The effect ofNotch-1 knockdown on the cell migration in the presence of dihydroartemisinin (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDHA group.

图4下调Notch-1表达后的Transwell迁移实验结果

讨论

骨肉瘤为骨外科中常见的好发于儿童和青少年的原发性恶性骨肿瘤，具有早期远端转移和高度局部复发倾向[7]。尽管近年来以外科手术辅助化疗的治疗措施上取得了较大进展，但患者的死亡率仍居高不下，最主要原因之一就是骨肉瘤很容易复发并迅速转移。目前临床上用于治疗骨肉瘤的药物大多毒副作用大，疗效较差[10]。因此，近年来寻觅一种新的安全有效的治疗方法成为骨肉瘤治疗的研究热点之一，对于提高患者的生存具有非常重要的意义。

青蒿素的早期研究主要是针对其高效的抗疟疾活性。多种青蒿素衍生物中以双氢青蒿素的水溶性良好，毒副作用最小。随着研究的深入，发现双氢青蒿素在抗肿瘤活性方面具有疗效强，且对正常组织细胞的毒性很低。Notch受体是一组高度保守的跨膜蛋白，与细胞的增殖、分化及凋亡具有密切关系。研究表明基质金属蛋白酶与Notch-1通路的信号有关，MMPs是一类锌依赖性的蛋白水解酶，与肿瘤迁移转移及血管重塑密切相关，MMP-2与MMP-9是家族中的一员[8, 11-12]。Hes-1作为Notch-1通路下游的靶基因，在Notch-1通路中起重要作用。本研究通过采用siRNA转染人骨肉瘤U-2OS细胞，探讨双氢青蒿素抗骨肉瘤的作用及其相关机制。免疫印迹法和real-time PCR检测结果表明双氢青蒿素呈浓度依赖性抑制U-2OS细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白和mRNA的表达。提示双氢青蒿素抗骨肉瘤作用与Notch-1通路的活性有关。

由上述实验结果表明在15 μmol/L与20 μmol/L的双氢青蒿素作用下，Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达和mRNA表达没有明显差异，因此在后续实验中采用15 μmol/L的浓度进行实验。下调Notch-1的表达后，MTT法检测结果表明双氢青蒿素能显著抑制U-2OS细胞的生长，表明下调Notch-1能增强双氢青蒿素抑制U-2OS细胞的生长能力。另通过免疫印迹法检测转染siRNA并采用双氢青蒿素孵育24 h后，U-2OS细胞中MMP-2、MMP9和Hes-1的蛋白表达水平明显降低，与加药组相比具有显著差异。进一步实验证实，下调Notch-1表达后，双氢青蒿素对U-2OS细胞活力的抑制作用增强，以及抗骨肉瘤作用也增强。再者，Transwell迁移实验证明，下调Notch-1表达后，在双氢青蒿素作用下，U-2OS细胞的迁移能力明显减弱。

综上所述，双氢青蒿素抗骨肉瘤的作用机制与Notch-1通路密切相关，提示下调Notch-1的表达可增强双氢青蒿素的抗骨肉瘤作用。

[参考文献]

[1]方淑斌，苏泽鑫，田京，等. 小干扰RNA诱导基因沉默对骨肉瘤调控的研究进展[J]. 广东医学, 2014, 35(19):3112-3114.

[2]Li Y, Zhang J, Zhang L, et al. Diallyl trisulfide inhibits proliferation, invasion and angiogenesis of osteosarcoma cells by switching on suppressor microRNAs and inactivating of Notch-1 signaling[J]. Carcinogenesis, 2013, 34(7):1601-1610.

[3]郭艳萍，杨广英，王建君. 宫颈癌组织中MCM-2、Notch1的表达变化及意义[J]. 山东医药，2012, 52(2):80-81.

[4]张勇，王德盛，周亮，等.Notch1在肝癌组织中的表达情况及其临床意义[J]. 中华消化外科杂志，2013, 12(5):378-382.

[5]Hu YY, Zheng MH, Zhang R, et al. Notch signalin pathway and cancer metastasis[J]. Adv Exp Med Biol, 2012, 727:186-198.

[6]Kimura K, Sakamoto Y, Fujisawa N, et al. Cleavage mechanism and anti-tumor activity of 3,6-epidioxy-1,10-bisaboladiene isolated from edible wild plants[J]. Bioorg Med Chem, 2012, 20(12):3887-3897.

[7]刘跃亮. 研究双氢青蒿素与人骨肉瘤细胞增殖、转移和凋亡的影响及机制探讨[D].重庆：重庆医科大学，2013.

[8]刘朝霞，王丹，丁娇，等.双氢青蒿素下调Notch1蛋白表达对人卵巢癌Skov3细胞抑制作用的研究[J].2014, 43(2):215-218.

[9]Whelan J, McTieman A, Cooper N, et al. Incidence and survival of malignant bone sarcomas in England 1979-2007[J]. Int J Cancer, 2012, 131(4):E508-E517.

[10]刘星辰，李洪伟，王烨，等. 双磷酸化合物对基质金属蛋白酶的抑制效应及机理[J]. 高等学校化学学报，2010, 31(1):88-93.

[11]孙颖，姜林娣. 基质金属蛋白酶(MMPs)在大动脉炎病情评估中的价值[J]. 复旦学报：医学版，2012, 39(5):541-544.

[12]徐建达，施鑫，吴苏稼，等. RECK、MMP-2在骨肉瘤中的表达及其临床意义[J]. 临床肿瘤学杂志，2010, 15(3):222-225.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81173372; No. 81101797)

Knockdown ofNotch-1 augments inhibitory effect of dihydroartemisinin on viability of human osteosarcoma cell line U-2OSQI Lei1, DUAN Yong-gang1, 2, DING Ying-qi2, ZHANG Long2, LIU Yu-zhang2, TANG Xiao-long2, WU Ji3

(1DepartmentofOrthopedics,ShanxiProvinceHospitalofTCM,Xi’an710003,China;2DepartmentofOrthopedicSurgery,TheSecondHospitalAffiliatedtoHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075100,China;3DepartmentofOrthopedics,AirForceGeneralHospitalofPLA,Beijing100142,China.E-mail:drduanyonggang@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of Notch-1 knockdown on the growth of dihydroartemisinin-inhibited human osteosarcoma cell line U-2OS. METHODS: U-2OS cells treated with different concentrations of dihydroartemisinin (5, 10, 15 and 20 μmol/L) were collected. The expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 at mRNA and protein levels was measured by real-time PCR and Western blotting, respectively. U-2OS cells were transfected with Notch-1 siRNA for 24 h and incubated with dihydroartemisinin for another 24 h. The cell apoptotic rate, protein expression of MMP-2, MMP-9 and Hes-1, and the migration ability were measured by MTT assay, Western blotting and Transwell experiment, respectively. RESULTS: Dihydroartemisinin (5, 10, 15 and 20 μmol/L) decreased the expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 at mRNA and protein levels in a dose-dependent manner. Down-regulation of Notch-1 significantly enhanced the effect of dihydroartemisinin on the cell apoptosis, the protein expression of MMP-2, MMP-9 and Hes-1, and migration ability (P<0.05). CONCLUSION: Notch-1 pathway is involved in the process of dihydroartemisinin-inhibited U-2OS cell growth. Knockdown of Notch-1 augments the inhibitory effect of dihydroartemisinin on U-2OS cell viability.

[KEY WORDS]Notch-1; Dihydroartemisinin; Human osteosarcoma cell line U-2OS; Cell viability

通讯作者△Tel: 0377-61660213; E-mail：huishuang1976@163.com

[收稿日期]2015- 05- 12[修回日期] 2015- 09- 24

[文章编号]1000- 4718(2015)12- 2126- 04

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.002

[中图分类号]R362

[文献标志码]A