孙 莉

（呼伦贝尔市食品药品监督管理局执法稽查支队 内蒙古 海拉尔 021008）

引言

蓝莓花青素是蓝莓鲜果中最为主要的活性成分，在实际研究分析时，因蓝莓花青素比较容易氧化，所以，国内外研究并未形成统一的定性以及定量测定方法。首先，针对花青素的定量测试方法主要包括正丁醇-盐酸法、香草酸-盐酸法、香草酸-硫酸法等。其中，花青素结构对正丁醇-盐酸法受的影响比较大，在这种情况下，不适合测定低聚合度花青素。香草酸-盐酸法在测定花青素含量较低的提取物水溶液时，体系透明度较低；干扰较大香草酸硫酸法时，由于硫酸的强氧化作用使得测定结果偏低。其次，定性方法包括红外吸收光谱法、高效液相色谱法(HPLC)等。其中，HPLC既可以对花青素定性也可以对花青素定量。基于此， 应利用此方法进行蓝莓中的花青素提取以及抗氧化活性分析。

一、蓝莓的生物活性物质

实验证明，蓝莓的果实与叶子均能够入药，其果实药性酸、甘、平，能够有效防止痢疾，叶片则性比较苦、涩、温，且有小毒，能够起到利尿、解毒的功效。蓝莓果实中包含大量的花色苷以及多酚类抗氧化活性成分，能够对人体内的自由基进行有效清除，起到预防癌症的作用。需要说明的是，蓝莓果实中包含丰富的果胶，蓝莓花色苷对血栓形成有良好的预防效果，进而能够降低心血管的发病几率。蓝莓花青素利用视网膜红色素的增加进而舒缓眼部疲劳，对人眼睛的机能能够有效改善，可以起到预防白内障的作用。蓝莓还可以起到延缓脑神经衰老的作用。再就是，蓝莓果实因其维生素含量比较丰富，因而能够起到促进创伤和骨折愈合的功效，提升机体免疫力。

二、蓝莓花青素提取与分析

（一）实验仪器和材料

1.实验材料

选取鄂伦春地区蓝莓鲜果若干；蓝莓花青素则通过实验室来加以制备；矢车菊素标准品，欧洲药典(EP)对照品，CAS号：528-58-5。

2.仪器与试剂

（1）仪器

微波合成萃取仪；DS-1型高速组织捣碎；色谱柱：KromasilRP-C18柱，合肥马伊娜分析仪器有限公司。

（2）试剂

对于新型“被XX”结构中“被”的归属问题各家说法不一，主要有助词/助动词说、否定标记说、类词缀说、副词说。除副词说认为“被”是实词外，其他几种说法都认为“被”是虚化程度较高的成分。

丙酮、乙腈、甲酸等试剂均为国产分析纯

（二）实验方法

1.原料预处理

选取若干蓝莓样品，其中，需要去除未成熟抑或出现破碎的样品，将选取的样品放至低温冰箱(温度为-20°C)中保存，使用时才取出，并用组织捣碎机捣成匀浆备用。

2.丙酮浸提法

（1）丙酮浓度对花青素提取效果的影响

称取五份重量为5.0g的蓝莓浆液，分别加入50%、60%、70%、80%、90%的丙酮溶液，料液比为1：4。在4°C的恒温水浴中封口振荡1.5小时后，加以过滤，以紫外-可见分光光度计在最大吸收波长下测定吸光度，确定最佳提取液浓度。

（2）提取温度对花青素提取效果的影响

称取四份重量为5.0g的蓝莓浆液，分别加入浓度为70%的丙酮溶液，料液比为1：4，分别在0°C、4°C、15°C、25°C下水浴中封口振荡1.5小时后，加以过滤，以紫外-可见分光光度计在最大吸收波长下测定吸光度，确定最佳提取温度。

称取四份重量为5.0g的蓝莓浆液，分别加入浓度为70%的丙酮溶液，料液比为1：4，在4°C的水浴中分别封口振荡0.5h、1h、1.5h、2h，加以过滤，以紫外-可见分光光度计在最大吸收波长下测定吸光度，确定最佳提取时间。

（4）料液比对花青素提取效果的影响

由图1可知，料液比为1：3时，花青素提取率最高。随着料液比的增大，提取得到的花青素含量也逐渐增加，当料液比为1：3时，提取率达到最大。当料液比大于1：3时，溶液中水的体积也增大，使水中吸附更多的氧，部分花青素因而被氧化，导致花青素含量降低。

图1 料液比对花青素提取率的影响

3.蓝莓花青素提取最佳条件

为了寻找蓝莓花青素的最佳提取条件，本试验对丙酮浓度、提取温度、提取时间、料液比4 个因子设计了 正交试验组合表( 见表1)。

实验结果表明，各因素对测定结果的影响次序为：提取温度>丙酮浓度>提取时间>料液比，从而得出最佳提取工艺是：70%两酮，提取温度为4℃，提取时间为1.5h，料液比为1：3。

三、蓝莓花青素的抗氧化活性分析

（一）实验内容

1.DPPH自由基的清除实验

图2 花青素对DPPH自由基的清除作用

表1 正交实验结果

由图2可知，蓝莓花青素和VC对DPPH自由基的清除率与它们的浓度存在剂量效应关系，且与蓝莓花青素和VC的浓度呈正相关性，并且在测定浓度范围内(5-25μg/mL)，表现出了清除率与浓度呈线性关系。清除 DPPH活性大小为：蓝莓花青素>VC。根据上图可以计算出，蓝莓花青素对DPPH的清除能力的IC50约为11.5μg/mL，而VC对DPPH的清除能力的IC50约为14.2μg/mL。抑制浓度越小，则表明清除 DPPH 的能力越强，因此，蓝莓花青素对DPPH 的清除能力强于VC。

图3 花青素对HO 自由基的清除作用

2.HO自由基清除实验

由图 3可知，蓝莓花青素具有较强的清除羟基自由基的能力。并且在测定浓度范围内(0.1-0.5rng/mL)，清除能力随浓度增大而增强，并呈现出较好的线性关系。在低浓度时，蓝莓花青素和VC对HO的清除能力比较接近；随着浓度的增大，两种物质对HO的清除能力相差越来越大。浓度相同时，对HO的清除能力大小为：蓝莓花青素>VC。据此可知，蓝莓花青素对HO的清除能力的IC50约为0.28mg/mL，而VC对HO的清除能力的IC50约为0.36 mg/mL，表明：蓝莓花青素对HO的清除能力强于VC。

图4 花青素对O2-自由基的清除作用

3.超氧阴离子自由基(O2-)的清除实验

由图4可知，蓝莓花青素和VC对O2-自由基都有一定的清除作用。在实验的 l0μg/mL-50μ g/mL浓度范围内，随着蓝莓花青素和VC浓度的升高，其清除作用也越明显，并且浓度与清除率之间具有较好的线性关系。据此可知，蓝莓花青素对 O2-自由基的清除能力的 IC50约为 29.34μ g/mL，而VC对O2-自由基的清除能力的IC50约为34.65μg/mL，表明：蓝莓花青素对O2-自由基的清除能力强于VC。

（二）蓝毒花青素抗氧化性能的研究

花青素类化合物对多种自由基都具有较强的捕捉能力。蓝莓花青素的抗氧化能力可以通过多种途径来表现，例如:通过与 O2-反应，来抑制活性氧自由基的作用；通过整合金属离子，来减少金属离子对氧化反应的催化作用；还具有阻止脂质过氧化反应。

本实验测定蓝莓花青素对DPPH自由基、HO自由基和超氧阴离子自由基(O2-)的清除能力。DPPH是一种很稳定的自由基，它的颜色减退程度与清除剂的清除能力及数量呈定量关系。该方法稳定性好、灵敏度高，被广泛应用于评价抗氧化物质的抗氧化能力；HO自由基和超氧阴离子自由基(O2-)在生命过程中会不断产生，是最具有代表性的自由基。而且HO自由基的氧化能力很强，能发生电子转移，且反应速度最快，对机体的损伤也最大；超氧阴离子自由基(O2-)的形成时间最早，它的危害性仅次于HO自由基。

四、小结

蓝萄花青素的抗氧化能力很强。蓝莓花青素能明显抵抗DPPH自由基、HO自由基和超氧阴离子 O2-自由基，并且蓝莓花青素对这三种物质的清除率均与花青素浓度呈线性关系。在实验的浓度范围内，蓝莓花青素对 DPPH自由基的最大清除率可达69.8%，对HO自由基的最大清除率可达74.8%，对超氧阴离子O2-自由基的最大清除率可达77.6%。而且，蓝莓花青素的抗氧化能力高于同等浓度下的VC。