核桃优良无性系组培初代培养条件探索

2016-01-24罗在柒颜凤霞

种子科技 2016年12期

关键词：褐化顶芽腋芽

罗在柒﹡，颜凤霞，田凡

（贵州省林业科学研究院，贵州贵阳 550005）

核桃优良无性系组培初代培养条件探索

罗在柒﹡，颜凤霞，田凡

（贵州省林业科学研究院，贵州贵阳 550005）

主要对核桃优良无性系初代培养外植体材料选择、消毒方法和培养条件进行探索，结果表明，核桃组培最佳外植体采集为3—6月份的茎尖，消毒方法应尽可能简便、快速，培养条件需经过低温暗培养，试验结果可为核桃良种组培开繁提供借鉴。

核桃；组织培养；外植体选择；消毒方法；培养条件

植物组培技术是工厂化生产中广泛应用的现代生物技术，也是快速繁殖植物新品种最主要的方法。迄今为止，植物组培技术在植物离体快繁、无病毒苗木培育、遗传育种及种质资源保存等方面都取得了显著成绩。GaleMcGranahan等报道，核桃成年品种离体繁殖已获成功，并已进行生产试验[1]。樊靖等报道了以5个核桃品种 (株系)10年生植株的茎段为外植体进行的离体培养和植株再生研究[2]。在核桃种胚的离体培养方面国内外学者也做了大量研究。优良无性系核桃组培由于树体本身富含多酚物质，易发生褐化，初代培养难度大。本文主要进行核桃优良无性系初代培养外植体材料选择、消毒方法和培养条件的探索，以期对核桃无性系组培提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

核桃优良无性系为黔林核1号（Juglans sigillata“qianlinhe-1”），1973年在牛棚初选，入选省级优树，1981—1990年进行无性系品比试验，筛选为优树，1985年命名为早熟露仁核桃，作为大面积推广的主栽品种。材料来源于贵州省林科院采穗圃。

1.2 方法

1.2.1 外植体选择

通过采集越冬顶芽和腋芽、萌动期顶芽和腋芽、快速生长期（半木质化）顶芽和腋芽等材料，分不同批次消毒和接种，材料大小以茎段长度为计量标准，设置1～4cm，对比统计不同时期外植体材料以及材料的大小在核桃组培过程中褐化和生长情况。

1.2.2 消毒与抑制物质筛选

消毒分为常规处理和新型消毒剂“山农I号”作对比。常规处理用自来水冲洗材料30 min；用洗洁净清洗材料，若大田材料污染较重，可以用软毛刷轻轻刷洗茎段和叶片，然后用自来水冲洗干净；用滤纸吸干其表面水分；置于2%硫代硫酸钠溶液中浸泡20～30min；用蒸馏水冲洗4～5次。山农I号，将外植体按要求枝剪后置于消毒液3min，直接接入培养基。抑制物质以活性炭、PVP（聚乙烯吡咯烷酮Polyvinyl pyrrolidone）等做对比试验，即每升培养基中添加1.5g活性炭和3.0gPVP，能有效抑制外植体褐化。

1.2.3 外植体培养

通过对照低温暗培养、常温暗培养和正常培养条件。正常培养条件白天温度为25±3℃，夜间温度为18±2℃，光照时间15h/d，光照强度2 000 lx，初代供试培养基均为改良DKW+BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L。

2 结果与分析

2.1 外植体材料筛选，获得脱毒有效外植体材料

不同时期采集外植体材料培养结果得到：越冬顶芽和腋芽虽然污染率高，但易于生长，黄化现象严重；萌动期顶芽和腋芽主要特点为褐化严重，外植体停止生长，其污染率低；快速生长期（半木质化）顶芽褐化相对严重，污染率相对高，腋芽能较好萌发，但脱离母体后停滞生长。

通过外植体材料生物量大小试验结果得到，核桃组培必须尽量增大外植体生物量，即外植体材料控制在4.0 cm左右，才能保证缓解外植体褐化，获得有效脱菌无性系材料。

核桃组培最佳外植体为3—6月份的茎段，且茎段的芽较粗壮，约为0.3～0.5 cm，茎部木质化程度不高的茎段萌芽率高。

2.2 外植体消毒方法的筛选

消毒方法的筛选主要是以控制外植体褐化，或者抑制启动褐化物质产生为原则，尽可能使消毒时间短、步骤少。通过试验得到应用过新型消毒剂，即“山农I号”消毒液能较好实现消毒效果，比常规试剂如氯化汞、酒精等消毒效果更好。

2.3 抑制外植体褐化物质的筛选

基本培养基筛选。通过试验，在培养基中降低硝基盐浓度，能缓解褐化发生，DKW培养基优于MS培养基。培养基中添加活性炭、PVP等物质能有效缓解外植体褐化，即每升培养基中添加1.5 g活性炭和3.0 gPVP能有效抑制外植体褐化。增加继代频次能使培养基多酚物质与外植体分开，一定程度上减少对外植体的伤害。外植体接种后，3～5 d内每天更换一次培养基，可以得到理想的效果。

2.4 培养条件的筛选

外植体接种后置于4℃冰箱暗培养3 d后，再继续置于组培室中培养，有益于防治褐化的发生。尤其注意在拿出冰箱后第二天开始出现轻度的褐化现象，接着第3、4天，褐化会加剧且污染茎段亦呈现，需及时处理。在第15天左右，会出现萌芽现象。萌芽后再转接培养很容易污染、长霉菌，特别是在长叶后更容易长菌污染且容易出现黄化现象，所以每隔3～5 d需转接一次。