樊　华, 李　文

第二军医大学长征医院生殖医学中心, 上海　200003



·综述·

雄性生殖氧化应激损伤的研究进展

樊华, 李文*

第二军医大学长征医院生殖医学中心, 上海200003

[关键词]抗氧化剂;活性氧簇；超氧阴离子;睾丸

Research progress of oxidative stress injury in male reproduction

FAN Hua, LI Wen*

Center of Reproductive Medicine, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

[Key Words]antioxidant; reactive oxygen species; superoxide anion; testis

近年来，每年都有许多研究专注于不同病理条件下的抗氧化剂的影响。这些研究结果显示大多数疾病中都有自由基(活性氧和氮自由基)的参与。有明确的证据显示，活性氧(氧化应激)和活性氮(硝化应激)数量的增加是许多急、慢性疾病(包括衰老过程)的突出特点。氧化/硝化应激与以下疾病的发病机制有关：心血管功能障碍，如高血压、脑血管意外、心力衰竭；生殖功能障碍；感染性休克；衰老和许多与年龄有关的慢性疾病，包括动脉粥样硬化、糖尿病、类风湿性关节炎和神经退行性疾病。

1男性生殖系统

男性生殖系统由睾丸和附属器官组成。睾丸是主要的男性生殖器官，它主要负责精子生成和雄激素的产生。精子生成是雄性生殖细胞向精子转变的过程，主要发生在曲细精管中。精子发生是一个连续的过程，包括生殖细胞的有丝分裂。该过程导致细胞形态发生广泛变化，并最终进行减数分裂，产生单倍体精子[1]。这个过程需要睾丸内较高水平的睾酮激素，该激素由睾丸间质细胞产生[2]。已经证明睾酮的分泌直接依赖于促黄体生成激素(LH)的循环水平，LH是由垂体前叶分泌的[2-4]。脑垂体也分泌卵泡刺激素FSH[3-4]，FSH与附着于生精小管支持细胞上的特异性FSH受体结合，引起这些细胞的生长并分泌多种生精物质，如精子细胞正常发育所需的营养、矿物质和生长因子。此外，垂体前叶还分泌催乳激素，支持细胞分泌抑制素，这两种激素已被证明在精子细胞的正常发育中发挥调控作用[3-5]。此外，一个涉及下丘脑的反馈机制调控着这些激素的释放。众所周知，睾丸功能的启动依赖于下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)，该激素刺激FSH和LH作用于睾丸[3-4]。睾丸反过来又通过在Sertoli细胞(如抑制素)和Leydig细胞中产生激素，对促性腺素(FSH和LH)的生成负反馈控制。因此，通过下丘脑、垂体和睾丸(下丘脑-垂体-睾丸轴)之间的相互关系，睾丸的功能受到局部细胞和内分泌细胞的严格控制。

正常的生殖功能对人类生殖和性满足至关重要。因此，生殖功能障碍(不育)是一个重大的健康挑战，正确理解其病理生理对此类疾病的有效治疗也至关重要。虽然生育能力会随着年龄的增加而下降，但不育通常是生殖功能障碍引起的，在男性中比女性中更为常见[6]，其中至少有20% 的患者患有内分泌紊乱，包括睾酮和FSH[6]。从目前的几项研究报告中可以看出男性生殖功能障碍与氧化/硝化应激有关联[7]。正常精子发生和精子功能受损是男性因素性不孕最常见的原因[6-7]。正常精子的数量和质量，包括运动、获能、顶体反应、穿透卵子和精子头部解聚，是实现受精必不可少的过程。然而，大量的研究表明，这些过程的障碍与氧化应激相关的机制有关[8]。

2睾丸中的ROS生成和抗氧化系统

有充分的证据表明，需要低水平的内源性ROS对必要的精子功能进行调控，如获能、顶体反应、精卵融合[9]等。然而，生精细胞是高度敏感的，容易受到高浓度ROS的影响[7]。因此，通过自由基清除/抗氧化系统的参与来维持睾丸环境中的氧化还原平衡对正常的睾丸功能是至关重要的。

正如在男性不育患者的精子中观察到的[10]，通过在精子质膜水平的NADPH氧化酶系统参与的反应、或通过线粒体中的NADH依赖的氧化还原酶(心肌酶)，均可以产生ROS。不同的研究者已经确定了高ROS产生的来源，包括未成熟的和异常的精子[9]，这些精子中有白细胞[11]污染，血清和精浆中有低的清除/抗氧化活性[12]。作为对包括炎症和感染等不同刺激的应答，通过几种机制精液中白细胞被激活，可以产生比正常精液相对更高(高达100倍)的ROS[13]。通过己糖磷酸支路，激活的白细胞使NADPH的生成增加，而两种被激活的多形核(PMN)白细胞和巨噬细胞的代谢过程引起呼吸爆发和高水平的ROS生成。在精子分析过程中，精液也可能通过精子处理方法在体外产生ROS，如过度离心、冷冻/解冻等，以及当精子处理液中有低清除/抗氧化活性存在时[8，12]。

为了保持睾丸内的氧化还原平衡，保护精子免受氧化损伤，精浆中含有大量有效的酶促和非酶促抗氧化系统。已确定的精浆中的酶促抗氧化剂包括SOD[14]、谷胱甘肽过氧化物酶/谷胱甘肽还原酶(GPx/GSR)系统[15]和过氧化氢酶[15]。在类似的研究中，在精浆中已确定的非酶抗氧化剂包括抗坏血酸[16]、维生素E、尿酸[17-18]、丙酮酸[19]、谷胱甘肽、牛磺酸和亚牛磺酸。据报道，一些抗氧化剂还可以提高精子活力/运动性[19]以及正常的精子形态[18]。此外，与不育男性相比，可育男性精浆中抗氧化剂的浓度显著更高[16-17]。

3睾丸功能障碍的发病机制

通过与膜脂、蛋白质和线粒体DNA相互作用，高水平的ROS(超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢、一氧化氮和过氧亚硝基阴离子)对正常精子的生成和质量(活动性、活力和功能)产生不利影响[20]。

3．1精子膜脂质的过氧化哺乳动物精子的膜含有丰富的不饱和脂肪酸(PUFA)，它负责精子的流动性，但同时也使精子对自由基诱导的脂质过氧化损伤非常敏感[20]。细胞膜上的不饱和脂肪酸的取向产生了精子执行其正常生理功能所必需的流动性(例如，在受精过程中的顶体反应和精卵融合)，其中涉及到各种分泌事件。类似的研究还表明，膜结合的ATP酶(离子泵)维持正常细胞内营养和离子(如钠或钙)浓度的功能严重依赖于细胞膜的流动性。这意味着ROS诱导的膜结构/功能的扰动引起膜流动性损失，从而损害膜泵功能，导致细胞的离子稳态和细胞钙的利用受到干扰。据报道，细胞Ca2+平衡受损影响精子的活力[21]，并可能导致细胞死亡。缺陷精子面对氧化应激反应尤其脆弱，因为他们包含了过多的不饱和脂肪酸，诱发精子线粒体发生高水平的脂质过氧化作用，产生ROS。更糟糕的是，脂质过氧化作用的小分子质量产物的亲电醛，如4HNE或丙烯醛等，也能进一步引起精子线粒体ROS生成[22]。

3.2精子蛋白的过氧化除了影响膜组分和流动性，ROS诱导的蛋白质关键硫基的过氧化也可以改变精子的结构和功能，使其对巨噬细胞攻击的易感性增加[23]。Turner等[8]在关于氧化应激诱导的睾丸功能障碍的综述中报道称，H2O2可以扩散通过精子膜，进入细胞并抑制酶的活性，如6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)。G-6-PD通过己糖磷酸支路控制葡萄糖流量速率，从而控制细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的可用性。精子使用NADPH作为电子来源，为从已知的NDPH氧化酶系统生成ROS提供燃料。氧化性谷胱甘肽(GSSG)经谷胱甘肽还原酶转换为还原型谷胱甘肽(GSH)时也需要NADPH。G-6-PD的抑制导致NADPH可用性的降低以及随之而来的GSSG的积累和GSH水平的降低，从而降低精子的抗氧化防御能力，增加膜磷脂的过氧化作用。

3.3精子DNA的过氧化已证明睾丸组织中的氧化应激可以引起精子DNA完整性的过氧化损伤，这已成为男性不育的热点研究领域。类似的研究已经确定了不育男性精子中的DNA损伤，其特征是高发生率的碱基修饰、DNA片段化、染色质交联和DNA链断裂[24]。在这些研究中观察到的DNA损伤是由精子中高水平的ROS引起的。Duran等[25]和Meseguer等[26]已经表明，精子细胞的DNA损伤可以引起精子质量下降和受精问题，因为在受精过程中精子需要完整的DNA。已知精子和其他富含线粒体的有氧细胞也可以发生线粒体DNA(mtDNA)的氧化损伤，在精原细胞阶段发生的自由基驱动的事件可以引起精子中多个mtDNA缺失，这与一些男性生殖障碍有关。精子DNA的破坏程度与细胞本身修复能力相关。在精核亚结构和线粒体中包含1种8-氧化鸟嘌呤糖基化酶，称为8-oxoguanine glycosylase 1 (OGG1)。当精子DNA受到氧化攻击时，OGG1立即在DNA中剪切8OhdG，并将其氧化形式排出细胞外，同时产生一个碱基空位。这时需要APE1酶在碱基切除修复通路中发挥作用，而精子不具备这种酶。这个过程需要进入卵母细胞后完成，一旦出错，将会对子代造成深远影响。尽管各种原因导致的精子DNA损害不可避免，但在体外严重的DNA损害可能不会发生在体内。

ROS诱导的DNA损伤增加了生殖细胞的凋亡率[24],凋亡也被描述为细胞程序性死亡。凋亡产生于引起细胞死亡但不发生炎症反应的细胞内程序的激活，这种诱导与细胞因子诱导的应激激酶对睾丸血管内皮细胞的E-选择素的刺激有关联，这导致睾丸中性粒细胞的募集和睾丸内ROS的增加，从而导致细胞膜的过氧化损伤和生殖细胞凋亡的启动[27]。虽然，在正常的精子发生过程中，生殖细胞凋亡对消除多余的未成熟精子是非常重要的，但如在氧化应激条件(例如，毒素暴露、隐睾、睾丸扭转等)下可以看到，当进程被上调时，睾丸功能受到高度破坏[28]。Cudicini等[29]和Lysiak等[30]报道称，生殖细胞凋亡特别影响生精上皮，在重度诱导过程中，Sertoli细胞吞噬大量濒死的生殖细胞，可能会超过正常Sertoli细胞的过程，启动了NF- κB参与的促炎症细胞因子表达的开关，如IL-1和IL-6。

4睾丸血管功能

睾丸内正常的微血管血流量对睾丸的功能是非常重要的，因为据报道，缺乏充足血流量可导致缺血和细胞坏死[30]。在大多数实验动物中，血管舒缩功能引起微血管血流量的变化[31]。血管舒缩被定义为血管张力有节奏的振荡，它是由血管和许多组织的局部变化引起的。虽然血管舒缩的生理学意义尚不确定，但有一些证据表明，当灌注受损时，即，在缺血的条件下，它可能作为一种保护机制。Lysiak等[32]报道称，在他们的研究中，在ROS介导的缺血性再灌注(IR)中发生的睾丸损伤可以引起大鼠睾丸血管舒缩的改变。另外，Collin等[31]表明，在大鼠中，ROS诱导的睾酮下降可以抑制睾丸血管舒缩。此外，Lysiak等[32]也表明，通过睾丸中iNOS和 eNOS的上调，IR事件会增加血管舒张复合物(NO)的表达。已经证实，一旦NO产生，它也会影响血管舒缩。NO参加其他可以促进睾丸损伤的事件，如在大鼠血管内皮细胞的管腔表面的细胞黏附分子(CAMS)的表达以及过氧亚硝酸盐的生成[33-35]。因为CAMs是白细胞募集的关键调节因子，它们在睾丸和其他组织中的IR诱导的损伤中起着关键作用。已普遍认为，在器官中，特别是在睾丸中，白细胞募集是许多后续IR病理学变化的先导。

5睾丸内分泌功能

睾丸氧化应激导致睾丸内睾酮量的减少，这可能是Leydig细胞损伤的结果，也可能是内分泌结构，如垂体前叶的损伤引起的[33]。类固醇生成的正常过程中产生ROS，这主要是线粒体呼吸和类固醇细胞色素P450酶的催化反应生成的。已经确认，如果不通过细胞内抗氧化剂加以控制，以这种方式产生的ROS可以引起精子细胞的线粒体膜的氧化损伤，并有助于抑制后续的类固醇生成[34]。在另一项研究中，已经证明睾丸中NO量的增加(随之形成过氧亚硝酸盐)可以降低睾酮的分泌[35]。

6诱导睾丸氧化应激的条件

已经确认有几种条件可以促进睾丸内的氧化应激并导致不育，包括老化、病理状态和暴露于一些有毒物质。

6.1老化氧化应激被认为参与有氧生物的老化过程[10]。随着年限年龄的增长，生殖细胞经历了反复多次的减数分裂复制，突变发生的风险是复制错误逐渐叠加的结果。通过激活对氧化还原敏感的转绿因子，年龄相关的氧化应激可以引起促炎症基因表达的上调，并建立了ROS与男性不育和年龄相关的病理的关联[2，10，14，35]。Luo等[34]和Cao等[36]在他们的研究表明，老化与睾丸抗氧化能力降低有关，而Zirkin等[33]报道称老化与睾酮或类固醇生成的下降有关。

6.2病理状态各种研究表明，某些病理条件下睾丸的病理生理过程与睾丸中的氧化应激增加有关。睾丸炎、睾丸扭转、精索静脉曲张和隐睾是已经被确认的几种可以引起睾丸内ROS水平上升的疾病[37,39]。睾丸炎的特征是局部睾丸感染或全身性炎症，而睾丸扭转是精索扭转的结果，可导致缺血。精索静脉曲张是由睾丸上部及周围的蔓状静脉丛扩张(尤其是左侧睾丸)引起的，其特点是由于循环障碍而导致的阴囊温度升高。隐睾是睾丸未降，发生时伴睾丸温度阴性升高。睾丸的基因组研究表明，局部睾丸感染或炎症过程引起人类生精障碍[37]。在其他研究中，在试验睾丸扭转和精索静脉曲张的大鼠对侧睾丸中观察到睾丸的氧化应激和损伤。Ishikawa等[38]和Misro等[39]也表明在试验性隐睾中发生了自由基的过表达和精子细胞的损伤。

6.3暴露于外源性化学物质有资料证明，当暴露于杀虫剂、工业化学品包括环境内分泌干扰物[39]和金属，如高剂量的铁、镉[6]和铅[40]时，睾丸发生氧化应激。此外，已报道一些治疗药物，如抗肿瘤药物、抗菌药物、抗疟药、钙通道阻滞剂和抗抑郁药可以通过增加睾丸中的OS损害睾丸功能。也观察到照射、过量饮酒和烟草烟雾[41]干扰氧化还原平衡。

7结论

过量的ROS会影响氧化还原平衡并导致氧化应激。氧化应激可以通过不同方式对细胞功能产生不利影响，并明显与睾丸功能障碍和其他疾病的发展相关。抗氧化剂可以使细胞保持足够的功能，抵抗稳态紊乱，其中包括氧化应激参与的过程。此外，补充抗氧化剂理论上可以保护或防止睾丸结构的过氧化损伤，可能对男性不育有帮助。在过去对通过某些抗氧化剂提高氧化应激引起的不育患者的生育能力这一概念有争议，但现在，在睾丸功能障碍并进行人工生殖治疗的情况下，这一概念得到了相当的关注。因此，对强效抗氧化剂和重要的促炎症介质的开发和专利申请以及对适当的药物输送系统的开发可能使医学普遍深度受益。

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[本文编辑]叶婷，贾泽军

[中图分类号]R 737.21

[文献标志码]A

[作者简介]樊华，主治医师. E-mail: fanhua20056@163.com*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-81885872, E-mail: lyyliwen@sina.com

[基金项目]军队创新重点课题(13cxz006). Supportedyoy Key Project of PLA (13cxz006).

[收稿日期]2016-01-08[接受日期]2016-04-10