武金霞，武建，隋思强，王静之，张贺迎

(1. 河北大学生命科学学院，河北保定　071002；2. 河北大学生物工程技术研究中心，河北保定　071002)

摘　要：以高脂饲料饲喂昆明种小鼠构建高血脂小鼠模型，灌胃给予高、中、低剂量(0.4，0.2，0.1 g/kg)蚯蚓冻干粉，每天1次，同时饲喂高脂饲料，以仅饲喂高脂饲料组小鼠为对照，共饲养10周.提取小鼠肝脏总RNA，应用半定量RT-PCR技术检测实验组与对照组小鼠胆固醇逆转运相关基因卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin cholesterol acyltransferase, LCAT)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)mRNA表达水平.结果表明，蚯蚓冻干粉极显著提高实验组小鼠LCAT mRNA表达水平(P<0.01)，显著提高LPL mRNA表达水平(P<0.05)，提示这是蚯蚓冻干粉能够降低高血脂小鼠血浆胆固醇水平的原因之一.

关键词：蚯蚓冻干粉；高血脂症；胆固醇代谢；卵磷脂胆固醇酰基转移酶；脂蛋白酯酶

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.009

蚯蚓冻干粉对高血脂小鼠胆固醇逆转运相关基因的调节作用

武金霞1，武建1，隋思强1，王静之1，张贺迎2

(1. 河北大学生命科学学院，河北保定071002；2. 河北大学生物工程技术研究中心，河北保定071002)

摘要：以高脂饲料饲喂昆明种小鼠构建高血脂小鼠模型，灌胃给予高、中、低剂量(0.4，0.2，0.1 g/kg)蚯蚓冻干粉，每天1次，同时饲喂高脂饲料，以仅饲喂高脂饲料组小鼠为对照，共饲养10周.提取小鼠肝脏总RNA，应用半定量RT-PCR技术检测实验组与对照组小鼠胆固醇逆转运相关基因卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin cholesterol acyltransferase, LCAT)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)mRNA表达水平.结果表明，蚯蚓冻干粉极显著提高实验组小鼠LCAT mRNA表达水平(P<0.01)，显著提高LPL mRNA表达水平(P<0.05)，提示这是蚯蚓冻干粉能够降低高血脂小鼠血浆胆固醇水平的原因之一.

关键词：蚯蚓冻干粉；高血脂症；胆固醇代谢；卵磷脂胆固醇酰基转移酶；脂蛋白酯酶

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.009

收稿日期:2014-09-25

基金项目：第一作者:武金霞(1966-)，女，河北曲阳人，河北大学教授，博士，主要从事生化药物及基因工程药物研究.;E-mail：wjx6@163.com

通信作者:张贺迎(1966-)，男，河北大城人，河北大学副研究员，主要从事生化药物研究.E-mail：z660128@163.com

中图分类号：Q507

文献标志码：志码：A

文章编号：编号：1000-1565(2015)02-0159-06

Abstract:Kunming mice were fed with high-level lipid feeds to establish the hyperlipidemic mice models. The mice were treated with earthworm lyophilized powder at dosages of 0.4, 0.2 and 0.1 g/kg once a day and were fed with high-level lipid feeds at the same time for 10 weeks, the mice fed only with high-level lipid feeds were as the control. The total RNA of liver was extracted, and the changes of liver lecithin cholesterol acyltransferase and lipoprotein lipase gene expression were analyzed by RT-PCR. The results indicated that earthworm lyophilized powder up-regulated lecithin cholesterol acyltransferase and lipoprotein lipase mRNA expression markedly, suggesting it was one of the reasons for reducing serum cholesterol in hyperlipidemic mice of earthworm lyophilized powder.

Regulation of earthworm lyophilized powder on reverse cholesterol

transport genes expression in hyperlipidemic mice

WU Jinxia1, WU Jian1,SUI Siqiang1, WANG Jingzhi1, ZHANG Heying2

(1. College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002,China;

2. Research Center of Bioengineering,Hebei University, Baoding 071002, China)

Key words: earthworm lyophilized powder; hyperlipidemia; cholesterol metabolism; lecithin cholesterol acyltransferase; lipoprotein lipase

蚯蚓冻干粉(earthworm lyophilized powder，ELP)是将鲜活的蚯蚓洗净、匀浆，经冷冻干燥得到的活性干粉，含有蚯蚓全部的活性成分，具有抑制肿瘤、降血脂、抗氧化等多种功能[1-5].前期研究表明，饲喂ELP可以显著上调胆固醇分解代谢关键酶CYP7α1和载脂蛋白AI mRNA表达[6]，下调载脂蛋白B mRNA表达[7].在复杂的胆固醇代谢网络中，胆固醇从外周组织向肝脏的逆向转运(reversecholesterol transfer, RCT)，是机体排出多余胆固醇的唯一途径，是维持胆固醇平衡的重要方式.卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin cholesterol acyltransferase, LCAT)) 是合成血浆中大部分胆固醇酯的主要酶类，作为胆固醇逆转运中的一个关键因子, 被认为具有抗动脉粥样硬化(AS) 作用.用催化中心附近的突变体LCATG179R质粒转染HEK293 细胞，发现突变引起蛋白质非正常折叠，导致酶活力降低[8].脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase, LPL)基因突变导致的功能缺失或分泌不足是患高血脂症的重要因素之一，LPL肝脏特异性敲除小鼠表现出严重的脂代谢紊乱，脂质清除能力缺失[9].LCAT和 LPL在胆固醇逆转运过程中起重要作用[10-12].本文报道了ELP对胆固醇代谢网络中LCAT mRNA和LPL mRNA表达的影响，为蚯蚓作为多方位有效的降血脂中药的应用提供了理论支持.

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1仪器

HC-2518R型高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司)，UV/vis2802型分光光度计(优尼科仪器有限公司)，PCR仪(杭州博日科技有限公司)，BG-power 600型电泳仪(北京百晶生物技术有限公司)，SIM凝胶图像成像系统(美国SIM仪器公司).

1.1.2实验动物

昆明种小鼠30只(体质量20~23 g)，河北大学医学部实验动物中心提供.

1.1.3实验材料及试剂

ELP购自天津贾立明蚯蚓养殖公司，小鼠饲料购自河北医科大学实验动物养殖中心，血脂指标和脂蛋白酯酶测定试剂盒购自中生北控生物科技有限公司，Taq DNA聚合酶和dNTPs 购自TaKaRa公司，TRIquick Reagent购自Solarbio公司，M-MuLV逆转录酶、Oligo d(T)15 和RNasin购自Promega公司，100 bp DNA ladder购自天根生化科技有限公司.

1.2　方法

1.2.1小鼠分组及饲喂

将30只雄性昆明小鼠随机分为5组，每组6只，1组饲喂基础饲料(记为NCG)，其余4组饲喂高脂饲料(记为HCG)，小鼠自由饮水，连续8周后取尾血测定血脂水平.

将24只造模成功的高血脂小鼠随机分4组，每组6只，在饲喂高脂饲料的基础上，灌胃不同剂量的ELP(生理盐水溶解)，分别为高剂量ELP(0.4 g/kg，HDG)、中剂量ELP(0.2 g/kg，MDG)、低剂量组ELP(0.1 g/kg，LDG)、单纯饲喂高脂饲料组(HCG)，与饲喂基础饲料组(NCG)小鼠做对照.小鼠自由摄食和饮水，每组小鼠每周称量1次总体质量，依据体质量变化重新计算灌胃ELP的量，且1周内按此量灌胃，共饲养10周.

1.2.2LPL活性测定

按试剂盒说明进行操作，LPL分解甘油三酯为甘油及游离脂肪酸，用铜试剂测定生成的游离脂肪酸的量即可计算酶活力.

1.2.3引物设计

在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/necleotide.htlm)中检索小鼠肝脏LCAT，LPL基因和内参基因β-actin的全长序列，利用Primer Premier 5.0软件设计3条基因的成对引物(表1)，送北京三博远志生物技术有限公司合成.

表1　PCR引物

1.2.4小鼠总RNA提取及鉴定

饲养结束后处死所有实验组小鼠，迅速取出肝脏投入液氮中，-70 ℃冷冻保存.依据Solarbio公司提供的RNA提取试剂盒说明书，提取小鼠的肝脏总RNA，琼脂糖凝胶电泳和分光光度法检验合格后冷冻保存.

1.2.5RT-PCR及产物检测

反转录：每个样本取2 μg总RNA，加入buffer(5×)4 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，Oligo(dT)152 μL，DEPC水补齐至18.5 μL.混匀后70 ℃变性10 min，后立即冰浴5 min.加入M-MLV(200 U/μL) 1 μL，RNasin(40 U/μL)0.5 μL，混匀，42 ℃ 反应1.5 h，94 ℃ 5 min灭活残存M-MLV，制备得到cDNA，4 ℃保存备用.

参照文献[13]进行PCR，反应体系及扩增条件见表2.

表2　PCR反应体系

表2中引物名称与表1中一致.

按表2加入各种成分，混匀，低速离心，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，49 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循环27次后，72 ℃后延伸10 min，4 ℃保存.

在同一块琼脂糖凝胶上点样每个实验组的所有小鼠同一个基因的PCR产物，电压5 V/cm条件下电泳，扫描电泳条带，保存图谱.

1.2.6统计分析

2结果

2.1　高血脂模型小鼠的建立

饲喂8周高脂饲料的小鼠，血浆总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇显著高于饲喂基础饲料的小鼠，而高密度脂蛋白胆固醇显著低于对照(表3)，说明高血脂模型小鼠建模成功，可以用来进行实验.

表3　高血脂小鼠的血脂指标

a.P< 0.01.

2.2　LPL活性变化

由图1可知，3个ELP添加剂量组均可以不同程度地升高LPL活性，与NCG相比，HDG和MDG的LPL活性有极显著性差异(P<0.01)，LPL活性在HCG和HDG 2组间表现为极显著差异(P<0.01)，3个实验组之间也有显著差异(P<0.05).

组别a. P< 0.01, vs. NCG; b. P<0.05,vs HCG;c. P<0.05,vs. HDG.图1　灌胃ELP对高血脂小鼠肝脏脂蛋白酯酶活性的影响Fig.1　Effect of earthworm lyophilized powderon LPL activity in mice

2.3　LPL基因 mRNA表达变化

图2为灌胃低剂量ELP组小鼠肝脏LPL mRNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱(灌胃高剂量ELP组和中剂量ELP组的对应图谱略).

由图3 可以看出，与HCG相比，3个实验组LPL mRNA表达水平显著提高，有显著差异(P<0.05)，MDG和LDG表达水平略低于HDG，但3个实验组之间无显著性差异(P>0.05).结合图1，表明饲喂ELP可以通过增强LPL的表达量来提高小鼠体内LPL总活力，进而起到降低胆固醇的作用.

图2　LDG(L1-L6)组小鼠肝脏LPL mRNA PCR 产物检测Fig.2　Products of LPL mRNA PCR in LDG(L1-L6) mice

组别a. P< 0.01, vs. NCG; b<0.05, vs. HCG; c. P<0.05, vs. HDG.图3　蚯蚓冻干粉对小鼠肝脏LPL mRNA表达的影响Fig.3　Effect of ELP on the LPL mRNA levelsin liver of mice

2.4　LCAT mRNA表达变化

图4为灌胃高剂量ELP组小鼠肝脏LCAT mRNA PCR产物琼脂糖凝胶电图谱(灌胃中剂量ELP、低剂量ELP组的对应图谱略).

由图5可以看出，HDG LCAT mRNA表达水平显著提高，与HCG组有显著差异(P<0.01)，并且与MDG，LDG组也具有显著差异(P<0.05)；MDG和LDG与HCG相比无显著差异，但MDG和LDG表达水平略高于HCG.

图4　HDG (H1-H6)组小鼠肝脏LCAT mRNA PCR产物检测Fig.4　Products of LCAT mRNA PCR in HDG(H1-H6)mice

组别a. P<0.01, vs NCG; b<0.05,vs HCG; c.P<0.05,vs HDG.图5　蚯蚓冻干粉对小鼠肝脏LCAT mRNA表达的影响Fig.5　Effect of ELP on the levels of hepatic expression of LCAT mRNA in mice

3讨论

前期研究发现ELP可以在转录水平上调CYP7α1 (P<0.01)基因表达，提示其可以促进胆固醇在体内的分解代谢，ELP还上调载脂蛋白AI，下调载脂蛋白B基因表达，下调HMG-CoAR的基因转录水平，这些结果提示ELP可以通过多位点调节胆固醇代谢的关键蛋白基因表达，起到降血脂作用.胆固醇代谢网络包括摄食吸收、体内自身合成、逆转运、排泄等多个代谢途径.LPL在肝细胞中合成，是一种酰基甘油水解酶，能水解乳糜微粒(chylomicron，CM)中的甘油三酯(triglycerol，TG)，将CM转化为富含胆固醇酯及载脂蛋白 E(apolipoprotein E，apoE)的残粒，残粒被肝脏摄取，其胆固醇则以非酯化的形式排入胆汁或用于胆汁酸的合成，从而加强了胆固醇的转化与排泄.因此LPL在极低密度脂蛋白(VLDL)和CM的分解及高密度脂蛋白(HDL)形成中起关键作用.本研究结果表明，各剂量组小鼠的LPL活性水平均高于对照组，说明ELP中含有某种活性成分可以调高该酶的生成或提高其活性，并且显示出一定的剂量效应.LCAT的主要功能是催化外周组织细胞、血液中的游离胆固醇结合于新生高密度脂蛋白(HDL)分子表面的磷脂形成胆固醇酯，促进HDL的成熟，HDL将多余胆固醇逆向转运到肝脏转化为胆汁酸形式排出体外.本研究结果显示，灌胃各剂量ELP后，各组小鼠LCAT mRNA的表达水平均显著上调.

ELP可以从多靶点调节胆固醇代谢网络，具有较全面而平衡的调脂作用，与单一成分降血脂药物相比，可以避免单一作用位点造成的某代谢产物的过度积累或缺失而产生的副作用，这可能是蚯蚓作为传统降血脂中药应用了几千年的原因之一.ELP本身含有众多活性成分，对其活性成分的分离分析及鉴定，明确具体成分的功能值得进一步研究.

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(责任编辑：赵藏赏)