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HPLC-CAD法测定远志药材中细叶远志皂苷的含量

2016-01-19刘利根

西北药学杂志 2016年1期
关键词:远志含量测定

刘 可,刘利根

(中国药科大学中药制剂教研室,南京 210009)



HPLC-CAD法测定远志药材中细叶远志皂苷的含量

刘可,刘利根*

(中国药科大学中药制剂教研室,南京210009)

摘要:目的建立高效液相-电雾式检测器(HPLC-CAD)方法测定远志药材中细叶远志皂苷的含量。方法色谱柱为Ultimate XB-C18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);柱温25 ℃;流动相为甲醇-0.3 mL·L-1磷酸溶液(60︰40);流速1 mL·min-1;进样量10 μL;电雾式检测器,雾化温度25 ℃,采集频率10 Hz。结果细叶远志皂苷峰面积与质量浓度线性回归方程:Y= 4.295 4X-0.135 8,r =0.999 9( n=6 ),线性范围为1.0~10.0 mg·mL-1;平均回收率为101.4 %。结论该方法高效、快速、准确,可作为药物及制剂中细叶远志皂苷的含量测定方法。

关键词:远志;细叶远志皂苷;HPLC-CAD;含量测定

远志是远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld.或卵叶远志PolygalasibiricaL.的干燥根[1]。细叶远志皂苷是远志皂苷碱水解的唯一产物,是控制远志总皂苷含量的指标性成分[2]。细叶远志皂苷可以显著抑制Aβ-淀粉样蛋白的分泌[3],且能透过血脑屏障[4]改善老年记忆障碍小鼠的学习记忆能力[5-6],具有良好的抗老年痴呆作用。

电雾式检测器(charged aerosol detection,CAD)是一种新型HPLC检测器,灵敏度和重复性高、动态检测范围宽、操作直观简单[7],不依赖化学结构的信号响应一致性,为通用性检测器,应用于中性、酸性、碱性及两性物质等,特别是无紫外吸收、非挥发性或半挥发性物质的检测[8]。近年来在各领域中显示出非凡的能力。本文采用HPLC-CAD方法测定远志药材中细叶远志皂苷的含量,建立一种准确、快速、高效的含量测定方法,对远志药材及细叶远志皂苷制剂的测定具有参考价值,对其类似化合物的测定提供了参考依据。

1仪器与试药

1.1仪器UltiMate 3000高效液相色谱仪,电雾式检测器,型号:Corona Ultra(美国Thermo Fisher Scientific公司) ;主要配置:泵(含内置脱气机),型号:HPG-3400;自动进样器,型号:WPS-3000TSL(带自动清洗针功能);柱温箱,型号:TCC-3000。

1.2试药细叶远志皂苷对照品(中国食品药品检定研究院,含量95.3 %,批号111849-201303);生远志Ⅰ(购于安徽省万生中药饮片有限公司),生远志Ⅱ(购于临湘市中药饮片加工厂),蜜远志(购于亳州市永刚饮片厂);甲醇(色谱纯,山东禹王实业有限公司);无水乙醇(分析纯,南京化学试剂有限公司)。

2方法与结果

2.1检测条件HPLC条件:Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇-0.3 mL·L-1磷酸溶液(60∶40);流速:1 mL·min-1;进样量:10 μL;柱温:25 ℃;CAD参数:采集频率10 Hz;雾化温度:25 ℃;

雾化气压:35 psi。

2.2对照品溶液的制备取细叶远志皂苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含10 mg的溶液,超声15 min,定容至刻度,即得对照品储备液。

2.3供试品溶液的制备取远志粉末(过三号筛)约1 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入体积分数为70 %的甲醇50 mL,称定质量,超声1 h,放冷,再称定质量,用体积分数为70%的甲醇补足质量,滤过,取续滤液25 mL,旋干,残渣加100 g·L-1的氢氧化钠溶液50 mL,加热回流2 h,盐酸调pH至4~5,用水饱和的正丁醇萃取3次,每次50 mL,合并正丁醇液,回收溶剂至干,残渣加甲醇适量溶解,转移至25 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,即得。

2.4线性关系考察精密吸取对照品储备液,以适量的甲醇将其分别稀释为1.0,2.0,4.0,6.0,8.0和10.0 mg·mL-1,按照 2. 1项下色谱条件检测,以细叶远志皂苷质量浓度(X)对峰面积(Y) 进行线性回归,得回归方程:Y=4.295 4X-0.135 8,r=0. 999 9(n=6)。结果表明,细叶远志皂苷在1.0~10.0 mg·mL-1范围内呈线性关系,且线性关系良好。

2.5方法学考察

2.5.1重复性实验取生远志Ⅰ6 份,分别制备供试品溶液[9],按照2.1项下色谱条件进样测定细叶远志皂苷色谱峰面积,计算其RSD值为 1.2 %。

2.5.2稳定性实验取生远志Ⅰ供试品溶液,按照 2.1项下色谱条件,每次进样10 μL,分别在0,2,4,8,16和24 h进样分析,测定细叶远志皂苷色谱峰面积,计算得其 RSD 值为1.1 %。结果表明,供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3精密度实验取3.69 mg·mL-1细叶远志皂苷对照品溶液,按照 2. 1项下色谱条件,每次进样10 μL,连续进样6次,测定细叶远志皂苷峰面积,计算得RSD值为 0.5 %。

2.5.4加样回收率实验取1.00 mg·mL-1生远志Ⅰ供试品溶液5 mL,平行3份,分别精密加入3.8,4.9和6.0 mg细叶远志皂苷对照品,按照2.1项下色谱条件,进样分析,测定细叶远志皂苷峰面积,计算加样回收率,结果回收率分别为100.8 %,100.4 %和100.9 %,平均回收率为100.7 %,RSD值为0.3 %。

2.6样品测定取生远志Ⅰ、生远志Ⅱ和蜜远志样品,按照2.3项下方法,分别制备供试品溶液,按照 2.1项下色谱条件分析测定,外标法计算生远志Ⅰ、生远志Ⅱ、蜜远志样品中细叶远志皂苷的质量分数。结果显示,生远志Ⅰ中细叶远志皂苷的质量分数为1.22%;生远志Ⅱ中细叶远志皂苷的质量分数为1.22%;蜜远志中细叶远志皂苷的质量分数为1.56%。见图1。

图1HPLC-CAD图

A.对照品;B.生远志Ⅰ;C.生远志Ⅱ;D.蜜远志

Fig.1 HPLC-CAD chromatograms

A.reference substance; B.crudeRadixpolygalaeⅠ; C.crudeRadixpolygalaeⅡ; D.honey processedRadixpolygalae

3讨论

CAD检测器作为一种新型通用检测器,检测信号不依赖被检测物质的化学结构,对不同结构的化合物有统一的响应[10]。现已应用于皂苷、糖、脂质和多肽等样品的检测[11]。与紫外和蒸发光散射检测器相比,CAD检测器对皂苷类成分的检测分析更加灵敏、准确和稳定[12]。对于CAD检测器,流动相中磷酸浓度过高,会造成基线噪音增大。因此,本实验选择了0.3 mL·L-1磷酸溶液作为流动相。CAD作为质量型检测器,可以通过适当增大进样体积来检测低浓度样品,或进行柱后有机相补偿,提高化合物的响应,降低定量检出限[13]。本实验建立了HPLC-CAD测定远志药材中细叶远志皂苷的含量测定方法。经过线性、稳定性、重复性、精密度和加样回收等方法学考察,结果表明本方法准确度高,精密度、重复性较好,质量浓度在1.0~10.0 mg·mL-1范围内,线性相关较好(r=0.999 9),可作为药物及制剂中细叶远志皂苷的含量测定方法,对皂苷类化合物及其类似化合物的测定具有参考价值。

参考文献:

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Determination of tenuifolin inRadixpolygalaeby HPLC-CAD

LIU Ke,LIU Ligen*(Department of Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicine,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a high performance liquid chromatographic with charge aerosol detection (HPLC-CAD) method for the determination of tenuifolin in Radix polygalae. Methods Ultimate XB-C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm) was used in the study and the column temperature was 25 ℃,and methanol-0.3mL·L-1phosphoric acid (60︰40) solution as the mobile phase with a flow rate at 1 mL·min-1;the injection volume was 10 μL;CAD:nebulization temperature was 25 ℃ and collection frequency was 10 Hz.ResultsThe equation of linear regression was Y=4.295 4X-0.135 8,r=0. 999 9(n=6),linear range was 1.0-10.0 mg·mL-1, and the average recovery was 101.4%. ConclusionThe method is accurate,rapid and high sensitive,which can be used in the quantitative determination of tenuifolin in protein pharmaceuticals.

Key words:Radix Polygalae;tenuifolin;HPLC-CAD;content

收稿日期:(2015-08-18)

通信作者:*刘利根,男,副研究员

作者简介:刘可,女,在读硕士研究生

中图分类号:R927.2

文献标志码:A

文章编号:1004-2407(2016)01-0034-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.011

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