原江锋，邱智军，刘建利，刘　贺,张　森

(1.河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.陕西省环境监测中心站，陕西 西安 710054)

连翘叶绿茶制备及活性成分分析

原江锋1，邱智军1，刘建利2，刘贺1,张森1

(1.河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.陕西省环境监测中心站，陕西 西安 710054)

摘要：为了进一步提升连翘叶的开发，将一芽二叶至一芽三叶的连翘嫩叶加工成连翘叶绿茶。对连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖的活性成分进行分析。分析结果表明：连翘叶绿茶含水量为36 mg/g。微量元素含量较高，茶多酚为172 mg/g，氨基酸为13.23 mg/g，咖啡碱29.3 mg/g，总黄酮26.48 mg/g，总木脂素19.76 mg/g，以及总三萜酸6.15 mg/g。具有较强的清除DPPH自由基的能力，这表明连翘叶绿茶含有丰富的对人体具有保健作用的活性成分。

关键词：连翘叶；绿茶；活性成分；自由基

基金项目：国家自然科学基金项目(U1404307);洛阳市科技攻关基金项目(1401076A,1201029A);河南科技大学大学生研究训练计划(SRTP)基金项目(2014113)

作者简介：原江锋(1978-),女,山西长治人,副教授,博士,主要从事生物活性成分的分析和应用研究.

收稿日期：2014-07-01

文章编号：1672-6871(2015)02-0078-05

中图分类号：S58

文献标志码：志码：A

0引言

连翘(ForsythiaSuspensa(Thunb.)Vahl)为木犀科(Oleacaae)连翘属(Forsythia)植物，落叶灌木[1]，以野生为主。分布于山西、河南、陕西、河北、山东、辽宁、湖北、四川、甘肃、安徽、江苏等省[2]，连翘果实为著名中药，功能清热解毒、主治心肺积热[3]；在河北、陕西等地有将连翘叶制成连翘茶饮用的习惯[4]，但对于连翘叶产品开发报道甚少。随着人们饮食结构发生的变化，寻求天然、安全、保健性的食品已成趋势。所以，开发资源丰富且具有较好营养和保健价值的连翘叶必将深受消费者喜爱。

为了开发利用连翘叶这一天然资源，本研究采用传统加工工艺制作连翘叶绿茶，通过感官审评品质；采用原子吸收光谱法测定微量元素；分光光度法测定茶多酚、氨基酸、咖啡碱、黄酮类、木脂素、三萜酸生物活性成分；以及清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的能力分析，得到具有较高营养保健功效的连翘叶绿茶，并以此促进连翘叶的高效综合利用。

1材料与仪器

K、Na、Zn、Fe、Mn、Ca、Mg、Cu标准品(中国医药集团上海试剂公司)；芦丁、五味子甲素和齐墩果酸(中国药品生物制品检定所)；靛红、KMNO4、HCl、碱式乙酸铅、谷氨酸、香草醛、变色酸、抗坏血酸(天津科密欧化学试剂有限公司)；咖啡碱、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，美国Sigma公司)；其余试剂均为分析纯。TAS-986型原子吸收分光光度计(北京普系通用有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(山东潍坊医药集团股份有限公司)，UV-9200分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，RE-52AA旋转蒸发器(上海嘉鹏科技有限公司)，KQ-600DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，FA2004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

连翘鲜叶采摘地点为河南省栾川县狮子庙连翘种植基地，鲜叶嫩度为一芽二叶至一芽三叶，采摘时选取无污染、无病虫害的完整叶片。桑叶茶由栾川县千山绿丰茧丝绸有限公司提供，信阳毛尖(一级)由信阳市浉河区建设茶叶精制厂提供。

2试验方法

2.1　连翘叶绿茶加工工艺

摊青：将鲜叶经捡剔后均匀摊放8 h，2~3 cm厚度，在自然环境条件下鲜叶中水的质量分数为70%(简称含水量，下同)左右。

杀青：将连翘嫩叶220 g放进杀青锅内，快速翻炒4 min，待叶质变软，叶色由鲜绿变为暗绿、青草气消失时出锅，控制连翘叶含水量50%~55%。

揉捻：待杀青叶冷却后按照轻-重-轻原则进行作业，揉捻至60%~80%成条率，茶汁明显溢出为适宜。

初炒：85 ℃锅温，以抓为主炒茶，炒至茶叶含水量降到45%时出锅，摊晾。

复炒：以抓炒为主，辅以轻轻搓揉。待含水量降至30%时改为以搓揉为主，所用力度随茶叶含水量下降而逐渐减弱。

干燥：在烘箱中进行，在100~110 ℃干燥10 min，烘至茶叶含水率6%以下时下烘。

2.2　连翘叶绿茶水份的测定

准确称取连翘叶绿茶3份，放在烘箱中，首先105 ℃烘10 min，然后80 ℃烘干至恒质量，称其质量计算出含水量。

2.3　连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖活性成分测定

矿质元素分析[5]：称取0.5 g粉碎的连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖分别于聚四氟乙烯坩锅内罐，加HClO4和HNO3浸泡过夜。次日于电热板上160 ℃进行消煮，至溶液无色透亮、全溶，继续加热近干，冷却后转移至25.0 mL的容量瓶中，用去离子水定容，备用；按同样方法制备空白样品。将8种矿质元素标准液配制成相关梯度溶液，以各矿质元素溶液浓度(C，μg/L)为横坐标(X)、吸光度(A)为纵坐标(Y)绘制矿质元素的标准工作曲线，用原子吸收分光光度计测定各样品中K、Ca、Mg、Fe、Zn、Na、Cu、Mn含量。

茶多酚含量测定：准确称取连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖粉碎样品1 g，放在三角瓶中，加蒸馏水80 mL沸水浴浸提30 min，抽滤、洗涤残渣，滤液倒入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀。按文献[6]高锰酸钾滴定法进行茶多酚的测定。

氨基酸含量测定：按文献[7]茚三酮溶液显色法进行。

咖啡碱含量测定：称取粉碎后的连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖样品各0.5 g于三角瓶中，加75 mL蒸馏水沸水浴45 min，趁热过滤，洗涤2~3次，冷却后用蒸馏水定容至100 mL。各移取10.0 mL溶液，加5.0 mL盐酸(0.01 mol/L)和1.0 mL碱性乙酸铅(0.5 g/mL)，除去提取液中的重金属离子，用蒸馏水定容至50 mL。移取上述溶液30.0 mL于分液漏斗中，用5.0 mL二氯甲烷萃取5次，萃取液转入50 mL容量瓶中，定容，按文献[6]紫外分光光度法进行咖啡碱的测定。

总黄酮含量的测定[8]：精密称取芦丁4.0 mg，溶于少量80%(体积分数)乙醇中，将溶液转移至容量瓶(10 mL)中，用80%(体积分数)乙醇定容至刻度得质量浓度为0.40 mg/mL的芦丁对照品溶液。精密吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL对照品溶液分别置于试管中，分别加入质量浓度为5%的NaNO21.0 mL，质量浓度为10%的Al(NO3)31.0 mL，质量浓度为40%的NaOH 1.0 mL，用体积分数为80%的乙醇溶液定容至10 mL，放置15 min。以上述溶剂为空白，分别在510 nm的波长处测定吸收度(A)值，溶液以所加的对照品量为横坐标，以A为纵坐标。得回归方程：Y=4.632X+0.034 7，r=0.998 2，n=6。由此可知：芦丁对照品在0.04~0.20 mg线性良好。分别精密称取粉碎后的连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖样品1.0 g，加入20 mL 80%(体积分数)乙醇，45 ℃超声提取1.0 h，两次，间歇搅拌，合并提取液后滤过，吸取0.3 mL样品溶液，置于试管中，按照标准曲线制备的方法，计算供试品中总黄酮的含量。

总木脂素含量的测定[9]：精密称取2.5 mg五味子甲素，溶于少量体积分数为80%的甲醇溶液中，移至10 mL容量瓶，得质量浓度为0.25 mg/mL的五味子甲素对照品溶液。精密吸取0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL对照品溶液分别置于6支离心管中，水浴挥去甲醇；然后，分别加入质量浓度为10%的变色酸澄清水溶液0.5 mL、浓硫酸3.0 mL、蒸馏水1.5 mL，摇匀后沸水浴30 min，迅速冷却。以上述甲醇管为空白，按分光光度计法，在570 nm的波长处测定吸收度(A)值，以所加的对照品量为横坐标，以A为纵坐标。取粉碎后的连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖各5 g，以10倍的80%(体积分数)甲醇为提取溶媒，超声处理(250 W，40 kHz)30 min，滤过，4 000 r/min离心5 min。按照对照品溶液制备方法加入相应试剂，以不添加提取溶液作为空白对照，在570 nm处测定吸光度。

总三萜酸含量的测定[10]：精密称取5.0 mg齐墩果酸，溶于无水乙醇中，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液。精密吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL对照品溶液置于试管中，水浴挥干乙醇，分别加入质量分数为5%的香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸溶液1.0 mL，密封混匀后，于60 ℃水浴下显色45 min，冰浴冷却，加冰醋酸定容至5.0 mL。以上述溶剂为空白，在550 nm的波长处测定吸收度(A)值，以所加的对照品量为横坐标，以A为纵坐标。得回归方程：Y=0.983X+0.076 9，r=0.999 7，n=6。由此可知：齐墩果酸对照品在0.04~0.20 mg/mL线性良好。取连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖，粉碎，各精密称取10.0 g置100 mL锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，超声处理(250 W，40 kHz)40 min，放冷，再称定，用甲醇补足损失质量，得供试品溶液。吸取样品溶液0.6 mL，置于试管中，绘制标准曲线，根据标准曲线计算供试品中总三萜酸的含量。

2.4　连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖清除DPPH能力

精密称取连翘叶绿茶、桑叶绿茶、信阳毛尖各0.5 g，置于三角瓶中，加入10 mL、95%(质量分数)的乙醇溶液混匀，超声处理(250 W，40 kHz)30 min，放冷，再称定，用95%乙醇补足损失的质量，滤过，滤液作为供试品溶液。在试管中依次加入3.4 mL、50 μmol/L DPPH甲醇溶液和0.6 mL不同浓度的供试品溶液或甲醇，剧烈振荡，室温保存在黑暗条件下30 min，517 nm处测定吸光值，计算DPPH自由基清除率(n=3)，并计算各供试品的IC50值[11]。

3结果与分析

3.1　连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖的感官品质比较

表1　连翘叶绿茶、桑叶绿茶、信阳毛尖感官评审百分制分数

根据已有文献报道[12-13]，从外形、汤色、香气、叶底等方面描述连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖的品质，结果见表1。3种不同茶叶表观外形、汤色、香气、滋味等方面都有一定的区别，具有各自独特的风格。与桑叶绿茶和信阳毛尖相比，连翘叶绿茶具有明显的连翘叶本身风味，微涩带青味。

3.2　连翘叶绿茶含水量分析

干茶的含水量一般要求低于6%(质量分数)，连翘叶绿茶含水量为3.6%，低含水量的连翘叶绿茶可以抑制微生物的生长和营养成分的质变反应，更耐贮藏，延长了连翘叶绿茶的保鲜期。

3.3　连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖中矿质元素的含量比较

矿物质和微量元素的存在与茶叶的药用、保健作用密切相关，对人体具有重要的生理功能。连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖样品中矿质元素及含量见表2。由表2可以看出：连翘叶绿茶含有丰富的K、Ca、Mg、Fe、Zn、Na、Cu、Mn，不同元素的含量大小顺序为Ca>Mn>Mg>Na>K>Zn>Fe>Cu。与桑叶茶、信阳毛尖的矿质元素进行比较可以发现：连翘叶绿茶中Ca含量高于信阳毛尖和桑叶茶中的含量；桑叶绿茶中Fe含量高于信阳毛尖和连翘叶绿茶；信阳毛尖中Zn、Mn、K、Mg、Na含量高于桑叶绿茶和连翘叶绿茶；连翘绿茶和信阳毛尖Cu含量相近，并且高于桑叶茶。连翘叶绿茶中矿质元素的种类和含量丰富，这对于连翘叶绿茶营养价值具有重要作用，而且对研究其医疗保健价值也具有重要意义。

表2　连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖样品中元素及含量　 mg/kg

3.4　连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖中营养及生物活性成分比较

连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖中茶多酚、氨基酸、咖啡碱、总黄酮、总木脂素、总三萜酸的含量比较见表3。由表3可以看出：连翘叶绿茶、桑叶绿茶、信阳毛尖中营养及生物活性成分的含量有明显的差异。其中，连翘叶绿茶中的茶多酚、氨基酸、总黄酮、总木脂素和总三萜酸的含量要高于桑叶绿茶和信阳毛尖；3种绿茶中的咖啡碱的含量有差异，为信阳毛尖>连翘叶绿茶>桑叶绿茶。研究结果说明：连翘叶茶的苦涩味主要是由茶多酚含量高造成的，这与茶汤滋味观察结果相一致；连翘叶绿茶中较高的氨基酸含量，虽然比不上肉类，但是与信阳毛尖和桑叶绿茶相比，含量仍较高，说明有极强的保健价值；连翘叶绿茶的黄酮类物质含量高，说明连翘叶绿茶具有较强的抗氧化能力；连翘叶绿茶总木脂素含量高，主要是由连翘苷和连翘酯苷的含量高造成的，这也与相关文献报道相一致[14]；连翘叶绿茶总三萜酸含量高，说明其具有抑制血管生成和抗肿瘤[15]等保健价值。

表3　 连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖中茶多酚、氨基酸、咖啡碱、

3.5　连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖提取物对DPPH自由基清除作用

清除自由基的强弱是评价抗氧化物质的抗氧化性好坏的一种重要指标。DPPH在有机溶剂中很稳定，是一种被广泛应用的自由基[16]。DPPH的有机溶剂呈紫红色，在517 nm处有一个特征吸收峰，但是当其遇到抗氧化剂时会褪色，吸光度变小。颜色越淡，吸光度越小，说明待测物具有较强的清除自由基的能力[17]。经过测定和计算，得供试样品连翘叶绿茶、桑叶绿茶和信阳毛尖清除率Y与浓度X之间关系为：

Y=0.359 8X-0.772 6,R2=0.998 2；

Y=0.288 7X-1.437 3,R2=0.997 3；

Y=0.469 7X-0.951 3，R2=0.996 5。

计算出IC50值分别为：信阳毛尖141.11 mg/L，连翘叶绿茶108.40 mg/L，桑叶茶177.38 mg/L。根据IC50值，清除DPPH自由基能力由强到弱依次为：连翘叶绿茶>信阳毛尖>桑叶茶，此结果与连翘叶绿茶的黄酮类物质含量最高结果相一致。

4讨论

连翘叶具有和连翘果实相似的化学成分，其医用保健功效已被证实[18-20]，但由于连翘叶没有进入《中国药典》，因此连翘叶尚未得到有效的利用。连翘叶作为一种集医药和保健于一体的绿色原料，具有广泛的开发利用前景。目前，有些科研部门正从连翘叶中分离、纯化木脂素化合物和黄酮类化合物，并将其利用到各个领域，必将产生划时代的意义。

通过本项研究，以连翘叶开发的绿茶，茶多酚、氨基酸、咖啡碱、总黄酮类、总木脂素类、总三萜酸化合物含量均较高，并且具有较强的清除DPPH自由基能力，说明连翘叶绿茶有非常强的保健价值，因此开发连翘叶绿茶具有极好的市场。充分利用连翘叶这一绿色资源，开发各种保健品、食品添加剂、食品、工业原料，使其真正形成一种新的茶文化外延。

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