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(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

苜蓿是我国目前种植面积最大的多年生豆科牧草，不仅营养价值高，而且产量丰富，被世界各地广泛栽培，具有保持水土流失，防沙固尘等作用，在我国畜牧业发展中占有举足轻重的地位[1]。优质苜蓿品种推广和抗性选育已取得了一定成效，但育成的优质抗逆性强的品种比较少。现代生物技术在育种上的应用，已成为苜蓿品种改良的重要手段。有关苜蓿不同组织器官离体培养已有报道，但对不同苜蓿品种的不同外植体愈伤组织诱导的比较研究报道甚少。对4种紫花苜蓿的不同外植体愈伤组织诱导进行比较分析，以期为紫花苜蓿应用生物技术进行抗逆性育种的研究工作奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试材料为龙牧801、龙牧81、敖汉、图牧2号4种苜蓿种子，均由黑龙江省畜牧研究所提供。

1.2 实验方法

1.2.1 无菌苗的培养

挑选籽粒饱满的4种苜蓿种子，温水中浸泡约2 h后，用 0.1%升汞消毒10 min，灭菌水冲洗后接种到MS+30 g蔗糖+10 g琼脂的基本培养基。培养条件为光周期16 h/d，光照强度1 000～3 000 lx的25 ℃培养箱中培养，使其种子发芽并获得无菌苗。

1.2.2 愈伤组织的诱导

取生长12 d的4种无菌苗的子叶、下胚轴、茎和叶片，将茎和下胚轴切割成5～7 mm，子叶和叶片分割成5 mm×5 mm大小。将分割好的不同外植体接在MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+30 g蔗糖的固体培养基中，每个品种的每种外植体接种8瓶，每瓶接种12块。培养条件同上，接种后第2天开始观察和记录不同外植体愈伤组织发生情况。

1.2.3 试验数据处理

对数据采用SPSS 17.0软件进行差异显著性和相关性分析。

愈伤组织诱导率(%)= 诱导愈伤组织数目/接种外植体数目×100%；

愈伤组织褐化率(%)= 褐化愈伤组织数目/接种愈伤组织数目×100%。

2 结果与分析

2.1 不同外植体愈伤组织发生的动态变化

对4种苜蓿不同的外植体的脱分化比较(见图1)，下胚轴愈伤组织的生长启动比较早，接种基本培养基中2 d后其两端或中间开始膨大发白，3 d后出现愈伤组织，茎次之，接入5 d后外植体开始增粗，愈伤组织在第8天开始显现，子叶和叶片愈伤组织的生长启动较晚，接种8 d后外植体才开始膨大卷曲，15 d后在子叶和叶片边缘逐渐形成愈伤组织。

在4种不同的外植体中，胚轴诱导产生的愈伤组织呈现淡绿色，生长迅速，但愈伤组织质地疏松。茎段诱导产生的愈伤组织呈现黄色、颗粒状、疏松易碎。子叶和叶片诱导产生的愈伤组织淡黄绿色、质地紧密。4种苜蓿的不同外植体在愈伤组织的发生上和愈伤组织的形态上产生了一定的差异。

注：A～D依次为龙牧801的茎、子叶、叶片、下胚轴诱导的愈伤组织 ；E～H依次为龙牧81的茎、子叶、叶片、下胚轴诱导的愈伤组织；I～L依次为敖汉的茎、子叶、叶片、下胚轴诱导的愈伤组织；M～P依次为图牧的茎、子叶、叶片、下胚轴诱导的愈伤组织。 图1 苜蓿不同外植体的愈伤组织

表1 品种间不同外植体愈伤组织诱导率(%)

外植体愈伤组织诱导率(%)龙牧801龙牧81敖汉图牧2号平均值下胚轴99．8±0．58aA99．5±0．17aA98．6±0．34aA99．7±0．12aA99．4茎95．9±0．43bB93．1±0．58bB90．0±0．35bB93．2±0．20bB92．3子叶90．0±0．54cC91．2±0．58bB89．2±0．32bB91．1±0．48cC91．1叶片86．6±0．35dD83．3±0．55dD82．2±0．35cC85．0±0．08dD84．3平均值93．0891．7890．0092．25

注：不同字母代表同一品种的不同外植体间的比较，小写字母代表0.05水平，大写字母代表0.01水平。下同。

2.2 不同外植体的愈伤组织诱导率

4种苜蓿品种的不同外植体接种到诱导愈伤组织的培养基后，愈伤组织的诱导效果和愈伤组织的生长情况区别很大。如表1所示，4种外植体均具有较强的愈伤组织发生能力，愈伤诱导率均在80%以上。不同的外植体愈伤组织之间诱导率存在显著差异，下胚轴诱导率最高，可达99%，与其它外植体之间差异显著，叶片的诱导率最低，为84.3%。在4种苜蓿中，龙牧801的诱导率相对高一些，龙牧81和图牧次之，敖汉的诱导率最低。4种苜蓿的不同外植体除龙牧81与敖汉的子叶与茎之间差异不显著外，其它外植体在愈伤组织的诱导率上均产生显著的差异(p<0.01)，外植体在接种28 d后，4种苜蓿的愈伤组织诱导率基本趋于稳定，部分愈伤组织开始变褐。

2.3 不同外植体诱导的愈伤组织的褐化率

在4种苜蓿愈伤组织诱导过程中，不用外植体诱导的愈伤组织都有不同程度的褐化。如表2所示，不同外植体诱导愈伤组织的褐化率之间差异显著，在褐化率方面，下胚轴的褐化率最低，平均为8.68%，茎和子叶次之，叶片的褐化率最高，达25.5%。在4种苜蓿品种间，龙牧801和龙牧81的外植体诱导愈伤组织褐化率较低，敖汉和图牧外植体诱导愈伤组织的褐化率相对较高。从愈伤组织的诱导率和褐化率综合分析，选择龙牧801苜蓿的下胚轴为理想的苜蓿愈伤组织的外植体。

表2 品种间不同外植体愈伤组织褐化率(%)

外植体愈伤组织诱导率(%)龙牧801龙牧81敖汉图牧2号平均值下胚轴6．70±0．06dD8．90±0．02dD9．80±0．05dD9．30±0．02dD8．68茎9．20±0．06cC10．2±0．01cC14．0±0．21cC15．0±0．09cC12．20子叶15．2±0．06bB18．8±0．28bB17．9±0．32bB16．0±0．38bB16．98叶片20．2±0．11aA26．0±0．26aA28．3±0．29aA27．5±0．28aA25．50平均值12．8315．9817．5016．95

2.4 不同外植体愈伤组织相关性分析

对不同苜蓿品种的不同外植体间的愈伤组织诱导率进行相关性分析，结果见表3。由表3可看出，茎和子叶的愈伤组织诱导率呈现极显著负相关。茎同下胚轴和叶片的愈伤组织诱导率呈现负相关，其它愈伤组织诱导率之间存在正相关。

表3 外植体诱导率的相关性分析

外植体下胚轴茎子叶叶片下胚轴1．000茎-0．7801．000子叶0．696-0．992∗∗1．000叶片0．854-0．3510．2331．000

3 讨 论

3.1 不同外植体的愈伤组织诱导能力

植物的遗传特性和外植体种类对愈伤组织的诱导及其分化能力产生显著影响[2]。诱导愈伤组织是建立在植物的再生体系或进行遗传性转化等的重要途径，也是产生变异，创造植物新品型的重要方法。而选择适宜的外植体是诱导出愈伤组织的前提条件[3]。本实验选用下胚轴、茎、子叶、叶片为外植体诱导愈伤组织，不同的外植体之间的生长启动以及生长速度之间呈显著差异，下胚轴和茎的愈伤组织启动时间要在子叶和叶片愈伤组织的启动时间之前。下胚轴的诱导率最高，与肖荷霞等[4]，王艳等[5]研究结果基本一致。同一外植体不同基因型的培养效果均无显著差异，而同一基因型不同外植体的培养效果均有显著差异。不同类型外植体培养的效果出现差异, 可能是因为胚轴、茎、子叶、叶片的生理状态和生育时期不同, 进而影响内源激素的水平的不相同。

3.2 愈伤组织的褐化

在本试验中，不同类型的外植体，诱导的愈伤组织都有不同程度的褐化。在组织培养过程中，褐变的产生原因受多种因子的影响。褐变的产生与外植体组织中所存在的酚类化合物的含量和多酚氧化酶的活性存在直接关系[6]。本试验借鉴前人的经验，选取了一系列有效措施抑制外植体的褐化。首先，选取生长粗壮、鲜嫩的无菌苗作为材料，初代培养后脱分化启动时间短，增殖速度快，成活率高；其次，适当地减少培养基中的激素和蔗糖的浓度，试验将2，4-D和蔗糖的量适度降低，来减少愈伤组织的褐化率。同时缩短转瓶周期为15～20 d，进而摆脱原培养基中褐色杂质积累的不利的影响。在4种苜蓿中，叶片的褐化率都最高，可能是叶片比其它3种外植体中酚类化合物含量多和多酚氧化酶活性比较高导致的。

4 结 论

对4种苜蓿的下胚轴、叶片、子叶和茎诱导愈伤组织，不同品种的外植体愈伤组织的诱导率以及褐化率呈现显著差异，下胚轴诱导的愈伤组织效果是最好的，褐化率也是最低；苜蓿不同外植体愈伤组织诱导率的高低为：下胚轴>子叶>茎>叶片；茎和子叶的愈伤组织诱导率存在极显著负相关。

[1]李望丰,吕德扬,刘艳芝,等.诱导苜蓿胚性愈伤组织分化和再生[J].吉林农业科学,2002,7(2):15-16.

[2]梁慧敏,黄剑,夏阳,等.苜蓿外植体再生系统的建立研究[J].中国草地,2003,25(4):8-14.

[3]唐玉倩,彭金环,于元杰.轮叶党参不同外植体愈伤诱导比较[J].分子植物育种,2010,8(5):951-957.

[4]肖荷霞,王瑛,高峰.外植体及激素对SANDITI紫花苜愈伤组织诱导和分化的影响[J].河北农业大学学报,2003,26(4):47-52.

[5]王艳,李波,徐长绘.苜蓿愈伤组织诱导及再分化研究[J].现代化农业,2005,5(6):1-3.

[6]赵蓬晖,张江涛,马红.植物组织培养中的几个常见问题与对策[J].河南林业科技,2002,21(2):27-28.