吴凡　李德臣　赵春晓　陈登松

摘要：概括了ISSR 分子标记技术的基本原理和特点，综述了其在家蚕相关领域中应用的研究进展，并展望了其在家蚕遗传研究上的应用前景。

关键词：家蚕；ISSR；遗传研究；应用

中图分类号：S881.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6124-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.004

Abstract： The basic principle and characteristics of Inter-simple Sequence Repeat （ISSR） was described. The application of ISSR in silkworm genetics was summarized. The application future in the study of silkworm was prospected.

Key words：silkworm；ISSR；genetics research； application

家蚕作为一种重要的经济昆虫，成为研究遗传、发育、生理、药代动力学等生物科学研究中理想的研究对象。常规的形态学标记在家蚕品种选育和鉴定等方面起到了一定的作用，但是很易受到内外环境条件的影响。随着分子标记技术的迅速发展，加锚微卫星重复序列（Inter-simple sequence repeat，简称ISSR）分子标记技术越来越多地被应用于家蚕的遗传多样性分析、基因定位及系统分类研究中。本文对 ISSR 分子标记技术的基本原理和特点及其在家蚕相关领域中的研究进展进行了综述，并展望了其在家蚕遗传研究上的应用前景，希望能对家蚕资源的研究及保存、鉴定和利用提供一定的参考。

1 ISSR分子标记技术基本原理和特点

1.1 ISSR分子标记技术的基本原理

ISSR分子标记方法是Zietkiewicz在微卫星技术（Simple sequence repeat，简称SSR）的基础上建立起来的一种新型分子标记技术[1]，根据其所使用的引物是否在3′端或5′端加锚定碱基可以分为锚定简单重复序列间扩增（Anchoredinter-simple sequence repeat，简称ASSR）和非锚定简单重复序列间扩增（Nonamchored inter-simple sequencerepeat，简称MP-PCR）。ASSR是在微卫星寡核苷酸引物的3′端或5′端加上2～4个随机选择的核苷酸，引起特定位点退火，保证引物与基因组DNA中SSR的3′端或5′端结合[2]，扩增重复序列间的片段。MP-PCR是直接以寡核苷酸引物进行PCR扩增，扩增重复片段和重复序列间的片段。扩增出来的条带可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，从而获得指纹图谱。

1.2 ISSR分子标记技术的特点

ISSR分子标记技术来源于SSR分子标记技术，因此具有SSR分子标记的优点，可在基因组上进行扩增，可以快速、准确和高效地检测出位于基因组DNA上的多态性，适用物种范围广，可以揭示不同SSR座位个体间的变异信息，提供多位点信息[3-5]，成本较低， 重复性好， 操作简单，非常适合于对大样本进行检测，而且该技术相比较于SSR技术，因为采用的引物序列比较长，其遗传多态性比较高，也同时提高了试验结果的可靠性。目前，ISSR分子标记技术在种群遗传学、种质资源、分类学与种系发生学等方面得到迅速应用[6-8]。

2 ISSR分子标记技术在家蚕遗传研究上的应用

2.1 遗传多样性

遗传多样性作为生物多样性的一个重要组成部分，是种群繁殖和更新换代的基础，可反映出物种对不用环境的适应能力，以及在环境的变化和变迁中所具有的持续计划的潜力[9]。ISSR分子标记能够揭示物种基因组内的多态性位点，是一种研究种群内及种群间遗传多样性的理想方法之一[10]。

Li等[11]证明了ISSR分子标记能够运用于家蚕遗传多样性分析，他们采用ISSR的方法，对42个家蚕品种进行扩增，有12条引物能扩增出清晰条带108条，其中多态性条带85个，且重复性较好，通过聚类分析，将这些品种分为7个亚群。房守敏等利用ISSR技术分析了6个家蚕品种和2个不同地域的野桑蚕群体的遗传多样性，6条ISSR引物共检测到66个位点，其中65个多态性位点，并根据遗传距离进行了聚类分析。Nagaraju等[12]采用ISSR技术对13个不同品种蚕的遗传多态性进行了分析。Pan等[13]采用ISSR技术分析了9个家蚕细胞培养系的多态性，26条引物扩增出797条多态性谱带，多态率为89.9%。

2.2 资源鉴定及分类

在对家蚕品种资源进行鉴定和分类时，由于其外部特征比较相像，中系一般为素蚕，日系一般为普斑蚕，虽然其大小有差异，但是仅仅根据其形态学，很难将其进行区分和鉴定，但是其个体所携带的遗传信息是不同的，因此可以根据其在基因组DNA上的多态性不同，将其准确地分类鉴定，ISSR 标记技术在家蚕资源的鉴定和分类中是非常有效的，可保证试验结果的科学性和可靠性。

Reddy等[14]以6条ISSR引物对13个滞育和非滞育家蚕品系进行了遗传鉴定，发现多态性占总数的77%。Velu等[15]采用ISSR分子标记研究了20个家蚕突变体的遗传变异关系，用15条引物扩增出113个标记，其中多态性的比率为73.45%，并进行了聚类分析，20个家蚕突变体可以分为6个类群，结果表明该技术是确定突变的家蚕品系之间遗传变异的一种重要方法。

2.3 指纹图谱的构建

许多研究已表明，ISSR分子标记技术在研究动物种间、种群间的亲缘关系以及动物系统发育方面也取得了很好的效果。Chatterjee等[16]分别采用RFLP和ISSR等分子标记的方法分析了家蚕遗传学，比较了这两种方法在家蚕遗传学研究上的应用，结果表明在指纹图谱分析中，ISSR分子标记技术更具有优势。Pan等[17]成功建立了BmE-SWU1和BmE-SU2两个家蚕细胞系，并获得了两个细胞系的ISSR指纹图谱。endprint

2.4 家蚕分子标记辅助选择育种

家蚕分子标记辅助选择（Marker assisted selection，MAS）是利用了遗传标记与控制数量性状的基因之间的连锁关系，在实际选择育种过程中，利用遗传标记和表型选择相结合的方式来代替常规的育种方法，从而选育出具有优良性状的家蚕实用品种，已成为家蚕优良品种选育过程中的重要方法，ISSR分析也可筛选出与优良表型性状基因紧密连锁的DNA片段，使其成为一种能够辅助育种的分子标记[18]。

Srivastava等[19]用15对引物对15个多化性家蚕品种进行ISSR-PCR分析，聚类分析结果表明这15个品种分成5个类群和1个隔离群，利用多重回归分析发现其中的5条带与热处理后的化蛹率相关，相关性最大的是标记8083000，该标记可以用于以分子标记辅助选择热耐受性家蚕品种的DNA标记。Chatterjee等[16]也采用ISSR分子标记的方法筛选了与家蚕发育及生产性状相关标记。Pradeep等[20]发现有ISSR标记830.8（1 050 bp）与家蚕幼虫体重、全茧量、茧层量显著相关，两个ISSR标记835.5（1 950 bp）和825.9（710 bp）与家蚕幼虫期显著相关。

3 ISSR分子标记技术在家蚕遗传研究上的应用前景

随着分子生物学的发展，ISSR分子标记技术已经是一个非常成熟的分子标记技术，它所需的设备技术简单，结果可靠，重复性强、多态性好等，对工作人员无危害。实践证明，该技术在很多物种例如长序榆[21]、玉米圆斑病菌[22]、石斛[23]、桑树[24]等，在研究其遗传多样性、亲缘关系、种质资源的鉴定等方面都得到了广泛的应用，具有很好的适应性。

家蚕作为一种模式生物和重要的经济动物，目前在家蚕研究中应用较多的分子标记是AFLP、SSR和RAPD，但是有关ISSR应用于家蚕研究的报道还不多。随着家蚕基因序测序的完整和基因组数据库的建立，很多SSR标记被发现和利用，ISSR标记是在SSR标记的技术上发展起来的，使用的引物可以是SSR引物，也可以是加锚的SSR引物，人们应该积极地拓宽该技术在家蚕遗传研究上应用的深度，特别是在家蚕种质资源的鉴定、遗传多样性、亲缘关系的分析、抗性育种等方面，积极借鉴在其他动物上成功应用的经验等，促进家蚕遗传育种的研究进展，ISSR分子标记技术将在家蚕新组合的早期鉴定中起到非常重要的作用，同时可以缩短育种年限、提高育种工作效率，促进家蚕品种的更新换代。

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