■周 凯 徐 慧 刘建军，

（1.齐鲁工业大学轻工学部，山东济南250353；2.山东省食品发酵工程重点实验室，山东济南250013）

白酒酒糟是白酒发酵的主要废弃物。酒糟中含有大量氨基酸、脂肪及多种微量元素等营养[1]成分，可以代替主粮添加进饲料[2-5]，达到缓解人畜争粮矛盾[6]的目的。酒糟添加进饲料可以降低饲料成本[7]、提高酒厂利润。但添加酒糟的饲料含有大量的木聚糖、甘露聚糖、大分子蛋白质、植酸以及退化淀粉等抗营养因子。为降解这些抗营养因子，大量产消化酶益生菌[8]被运用于饲料生产中，多酶益生菌饲料[9]应运而生。多酶益生菌饲料是采用微生物发酵的方法对饲料底料进行发酵生产的营养价值高、易被消化吸收、富含多种消化酶且兼具有一定的益生特性[10]的饲料。在多酶益生菌饲料制备过程中，菌种的选择至关重要。利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵生产的饲料具有富含多种消化酶、安全无毒等特性[11-12]。饲料中添加乳酸菌（Lacticacid bacteria）则可以改善饲料风味，提高饲料适口性[13]。除此之外，枯草芽孢杆菌与乳酸菌互利共生，共同培养可以有效抑制大肠杆菌等好氧致病菌的生长繁殖[14]。因此，目前大多数多酶益生菌饲料均采用枯草芽孢杆菌和乳酸菌作为发酵菌种。

试验选择实验室保藏的产木聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶、蛋白酶、淀粉酶的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌对添加白酒酒糟的饲料底料进行发酵，制备多酶益生菌饲料。以产酶菌种的活菌数与酶活在一定范围内呈正相关[15]为理论依据，考察多酶益生菌饲料中底物的各组分比例及发酵条件对益生菌活菌数的影响。通过单因素和正交试验探究制备多酶益生菌饲料的工艺，为多酶益生菌饲料的规模化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

试验选择产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌L-1、产植酸酶的枯草芽孢杆菌L-2、产木聚糖酶的枯草芽孢杆菌YB-5，改善饲料风味的乳酸片球菌Rp。以上菌种均由实验室保藏并提供。

1.1.2 原料

白酒酒糟、玉米粉、麸皮、豆粕。

1.2 培养基及试剂

①乳酸片球菌种子培养基(g/l)：牛肉膏 10、蛋白胨10、酵母粉5、葡萄糖5、醋酸钠5、柠檬酸二铵2、吐温80 1，pH值6.5～6.8，37 ℃静置培养6 h接种。

②枯草芽孢杆菌种子培养基（g/l）：蛋白胨10、牛肉膏5、氯化钠3，pH值7.0，37 ℃、180 r/min培养5 h后接种。

③ 平板计数培养基（g/l）：蛋白胨10、牛肉膏5、酵母粉5、葡萄糖5、醋酸钠5、柠檬酸二铵2、吐温80 1、琼脂条20，pH值6.5，涂布后培养24 h计数。

④ 初始固态培养基：酒糟400 g、玉米粉250 g、麸皮200 g、豆粕150 g，初始pH值7.0，37 ℃培养72 h，测定酶活及活菌数。

以上培养基均在温度121℃、时间20 min条件下灭菌。

1.3 试验方法

活化益生菌种产甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌L-1、产植酸酶的枯草芽孢杆菌L-2、产木聚糖酶的枯草芽孢杆菌YB-5、乳酸片球菌Rp。接种顺序为L-2先接种4 h，再同时接L-1、YB-5、Rp；L-1、L-2、YB-5、Rp接种比例为1∶1∶2∶4；接种量为15%，37℃下培养84 h，发酵结束后取样检测指标。

1.4 检测方法

1.4.1 多酶益生菌饲料活菌数测定（平板计数）

取发酵结束后的多酶益生菌饲料1 g，置于100 ml蒸馏水中，加入玻璃珠振荡摇匀30 min。进行10-1～10-11梯度稀释，摇匀后以0.2 ml稀释液涂布计数。选择菌落个数在10～300以内的平板计数，数据以同梯度三个平板菌落平均数为准。

1.4.2 酶活测定

固体样品测定时取发酵结束后的多酶益生菌饲料5 g，稀释到50 ml加玻璃珠振荡30 min。4 000 r/min离心20 min，以上清液为粗酶液。以不同的方法测定饲料样品中的酶活[16]。

液体样品以4 000 r/min转速离心20 min后取上清液为粗酶液。

测定甘露聚糖酶酶活采用DNS法[17]；植酸酶酶活测定采用钼黄法[18-19]；木聚糖酶活测定采用DNS法[20]；蛋白酶酶活测定采用考马斯亮蓝法[21]；淀粉酶酶活测定采用DNS法[22]。

2 结果与分析

2.1 底料组分对多酶益生菌饲料中益生菌活菌数的影响

2.1.1 白酒酒糟含量对活菌数的影响(见图1)

图1 白酒酒糟含量对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

白酒酒糟可以丰富多酶益生菌饲料底料中的蛋白种类。除此之外还可以降低底料中的黏性，利于好氧益生菌的生长繁殖。分别取占发酵干基底料8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、52%质量分数的白酒酒糟进行试验，发酵结束后取样测定多酶益生菌饲料中的益生菌活菌数。图1表明，白酒酒糟含量在35%～45%之间，活菌数最多。

2.1.2 玉米粉含量对活菌数的影响(见图2)

图2 玉米粉含量对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

试验中考察玉米粉含量对多酶益生菌饲料中活菌数的影响。如图2所示，玉米粉占发酵干基底料质量分数在20%～30%时菌体活菌数均维持在一个较高的水平。

2.1.3 麸皮含量对活菌数的影响(见图3)

图3 麸皮含量对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

试验中麸皮含量对活菌数影响较大。如图3所示，干基底料中麸皮含量在20%～30%（m/m）之间时活菌数达到最大值。

2.1.4 豆粕含量对活菌数的影响(见图4)

图4 豆粕含量对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

豆粕在饲料中添加可以丰富饲料中蛋白种类，饲料中豆粕含量的改变会引起活菌数的变化。如图4所示，干基底料中豆粕含量在7%～9%（m/m）范围内活菌数含量最高。

2.1.5 料水比对活菌数的影响(见图5)

图5 料水比对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

多酶益生菌饲料发酵中水活度对活菌数影响较大，当饲料中含水量较低时菌体生长繁殖受到抑制，活菌数含量较低。水分含量较高时，饲料黏性升高，降低溶氧量，导致活菌数较低，图5表明，料水比为1∶0.8时活菌数取得最大值。

2.1.6 硫酸铵含量对活菌数的影响(见图6)

图6 硫酸铵含量对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

试验选择硫酸铵溶入水中作为多酶益生菌发酵中的无机氮源，丰富氮源种类，提高益生菌活菌数含量。图6表明，在水中溶解质量分数为2.0%硫酸铵时活菌数含量达到最大值。

2.1.7 尿素含量对活菌数的影响(见图7)

图7 尿素含量对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

尿素作为无机氮源硫酸铵的补充添加进饲料当中，图7反映出当尿素质量占水分质量的1.1%时，活菌数维持在较高水平。

2.1.8 多酶益生菌饲料组分含量的正交试验

在单因素试验的基础上选择发酵过程中对活菌数对应含量最高的麸皮、料水比、酒糟、豆粕、尿素为因素，设计5因素4水平设计正交试验表（见表1）考察多酶益生菌饲料中活菌数，最终确定多酶益生菌饲料中各组分含量。

2.1.9 正交试验结果

根据正交表L16(45)进行试验，试验结果见表2。

对表2进行极差分析可以看出，组合A3B2C1D4E3为优势组合。试验无此组合，故选择活菌数最大的A2B2C1D4E3为优势组合，即麸皮含量在28%，料水比为1∶0.8酒糟含量36%，豆粕含量8%，尿素值为1.1%。因四种固态底料成分之和为100%，故确定玉米粉质量分数为26%，此时活菌数到达最大值1.8×1011cfu/g。随后对试验结果进行方差分析（如表3所示）。其中，因素A麸皮含量和因素B底料含水量对多酶益生菌饲料发酵中益生菌活菌数影响最大。

表1 正交因素水平设计

表2 正交试验结果

表3 方差分析

2.2 发酵条件对多酶益生菌饲料中益生菌活菌数的影响

在确定多酶益生菌饲料的底料组分后，继续试验考察发酵时间、温度、初始pH值以及固料装填量对益生菌活菌数的影响，确定发酵条件。

2.2.1 发酵时间对活菌数的影响（见图8）

图8 发酵时间对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

在固态发酵过程中，随着时间的增加，多酶益生菌饲料中活菌数逐渐增加，但是随着时间的推移，多酶益生菌饲料中益生菌数逐渐达到临界，在此之后活菌数不再增加。如图8所示，发酵进行到在84 h时活菌数达到最大值。

2.2.2 发酵温度对活菌数的影响（见图9）

图9 发酵温度对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

试验过程考察多酶益生菌饲料在不同培养温度下的活菌数变化趋势，图9表明，当温度在35～37℃范围时，活菌数达到最大值。

2.2.3 初始pH值对活菌数的影响（见图10）

图10 初始pH值对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

调节多酶益生菌饲料培养基中的初始pH值，发现初始pH值在6.5～7.5范围内对活菌数影响不大，参考图10数据取初始pH值7.0作为发酵pH值。

2.2.4 装填量对活菌数的影响（见图11）

图11 摇瓶装填量对多酶益生菌饲料中活菌数的影响

如图11所示，在250 ml摇瓶中分别装填14、16、18、20、22 g固态发酵底料，检测发酵结束后益生菌活菌体的数量。发现摇瓶装填量在20 g/250 ml时，活菌数最大。

2.3 验证试验

在单因素结束后，确定最佳发酵条件为：初始pH值7.0、温度37℃、装填量20 g/250 ml条件下发酵84 h。在此条件下进行验证试验，结果如表4所示。

表4 验证试验结果

3 讨论与小结

通过单因素及正交试验得到多酶益生菌饲料发酵生产的最优条件为，干基中麸皮含量为28%、白酒酒糟含量36%、玉米粉含量26%、豆粕含量8%；料水比为1∶0.8，水中含有2.0%硫酸铵和1.1%尿素。在初始pH值为7.0、温度为37℃、装填量为20 g/250 ml条件下发酵84 h。测得该多酶益生菌饲料中益生菌活菌数为1.97×1011cfu/g、木聚糖酶酶活达到15.30 U/g、植酸酶酶活16.37 U/g、甘露聚糖酶酶活11.62 U/g、淀粉酶酶活19.37 U/g、蛋白酶酶活15.27 U/g。在最优条件下，多酶益生菌饲料各指标均有较大幅度的提高，其中麸皮含量与料水比在试验中对多酶益生菌饲料的活菌数影响最大。在生产多酶益生菌饲料的同时，充分利用了白酒酒糟当中的营养成分，为白酒酒糟的高附加值利用提供了可行的途径。