不同来源的蛋白水解物对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫的影响

2016-01-10张婷婷陈效儒梁萌青郑珂珂徐后国陈齐勇

饲料工业 2016年12期

■张婷婷陈效儒梁萌青郑珂珂徐后国陈齐勇

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071；2.通威股份有限公司，四川成都610063；3.大连海洋大学，辽宁大连116021)

水产饲料长期以来依赖鱼粉为主要优质蛋白源，但随着集约化水产养殖业的扩大与发展，鱼粉的需求量急剧上升，导致鱼粉的价格不断攀升，单纯依靠鱼粉为饲料蛋白源已经难以满足水产养殖业的发展要求[1-2]。国内外相关研究表明，蛋白水解物在酶解和加热处理过程中能够消除大部分植物蛋白源中抗营养因子，同时蛋白水解物通过水解后脂肪含量、灰分含量很低，且富含低分子小肽和游离氨基酸，目前已经成为解决鱼粉短缺问题的一个重要途径[3-6]。鱼蛋白水解物含有丰富的生物活性肽和游离氨基酸，并且具有促进生长、提高抗氧化性、增强免疫力等生理功能[7-8]，鱼蛋白水解物可增强花鲈(Lateolabrax japonicus)的非特异性免疫[9]；猪血蛋白水解物是一种具备保健功能、经济效益高、游离氨基酸含量高的氨基酸营养液[10]，将新鲜猪血彻底水解后，产物是一种对机体具有免疫增强活性且长度不等的小肽混合物[11]；豆粕经酶水解可去除其中大部分抗营养因子、可溶性碳水化合物和粗纤维等[3]，大豆蛋白水解物可提高仔猪的生长性能、营养物质消化率及免疫功能[3]；酵母水解物富含小肽、游离氨基酸、核苷酸及丰富的B族维生素[12]，饲料中添加酵母水解物可提高大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼非特异性免疫能力[13]。

本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为对象，研究饲料中分别以鱼蛋白水解物(Fish protein hydrolysate，FPH)、猪血蛋白水解物(Pig blood protein hydrolysate，PBPH)、豆粕蛋白水解物(Soybean protein hydrolysate，SPH)、酵母蛋白水解物(Yeast protein hydrolysate ，YPH)替代鱼粉(Fish meal,FM)，对其生长性能、饲料利用、体组成成分及非特异性免疫的影响，为蛋白水解物在对虾饲料中的应用提供技术数据。

1 材料与方法

1.1 蛋白水解物的制备

以鳕鱼排、猪血粉、豆粕粉、啤酒酵母粉为原料，参考Zheng等(2012)的方法，采用酶解技术，利用风味蛋白酶(Flavourzyme)和碱性蛋白酶(Alcalase)联合水解，然后冷冻干燥得到四种蛋白水解物，分别为鱼蛋白水解物(Fish protein hydrolysate，FPH)、猪血蛋白水解物(Pig blood protein hydrolysate，PBPH)、大豆蛋白水解物(Soybean protein hydrolysate，SPH)和酵母蛋白水解物(Yeast protein hydrolysate，YPH)。置于-20 ℃冰箱，保存备用。

1.2 实验饲料

实验以鱼粉和豆粕为主要蛋白源，鱼油为主要脂肪源，对照组(FM组)鱼粉含量为25%，实验组分别以鱼蛋白水解物、猪血蛋白水解物、豆粕蛋白水解物、酵母蛋白水解物替代10%的鱼粉蛋白，记作FPH组、PBPH、SPH和YPH组，配置成5组等氮、等脂的配合饲料，实验饲料原料均粉碎过80目筛后，加工制成直径为1.2 mm的5种等氮、等脂的配合饲料，55℃烘饲料至水分5%～10%，置于-20℃冰箱中保存备用，饲料配方和营养水平如表1所示，饲料氨基酸组成见表2。

1.3 实验动物及饲养管理

养殖实验在中国水产科学研究院黄海水产研究所鳌山卫养殖基地进行，实验开始前，暂养两周使其适应养殖环境。实验开始时，停食24 h，选择大小均匀、健康且体表无病的凡纳滨对虾(2.39±0.10)g，随机将虾分于15个养殖桶(水体体积120 L)内，每桶20尾。实验过程中按对虾体重的5%～10%进行投喂，然后根据每天各桶的摄食情况进行适当调整，每天投喂4次，投喂时间为7：30、12：00、16：00和21：00，各时间点投喂量占日总投量的比例分别为30%、20%、30%、20%。养殖实验共进行68 d，饲养期间连续充气，每日换水1次，日换水量为桶内水量的1/3，水温27～30℃，盐度30左右，pH 值为7.2～7.5，溶解氧含量在7 mg/l左右，氨氮低于0.5 mg/l。

表1 饲料配方及营养水平(%)

1.4 样品采集

实验开始前，取12尾对虾用于体成分分析。实验结束后，停食24 h，称重并记录尾数，然后每桶中随机选取5尾对虾，保存于-20℃冰箱中，用于全虾体成分分析；每桶再另取10尾虾，用1 ml无菌注射器从对虾头胸甲后缘围心窦入针取血，注入1.5 ml离心管中，置于4℃冰箱中静置24 h后10 000 r/min离心，取上清液保存于-80℃冰箱中备用；采血后剥去肝胰腺，将取出的肝胰腺放于1.5 ml离心管中，置于-80℃低温冰箱中保存备用。

1.5 测定指标

1.5.1 体成分分析

蛋白水解物、饲料和全虾样品在105℃烘干至恒重，通过失重法测定干物质含量，然后进行生化测定。粗蛋白采用凯式定氮法(凯氏定氮仪，意大利，VELP UDK142)测得；粗脂肪采用索氏提取法(索氏抽提仪，丹麦，SOXTECTM2050)测得，以石油醚作为抽提液；灰分测定先将样品炭化至无烟，然后放入马福炉中550℃燃烧16 h，失重法测定灰分含量；蛋白水解物、饲料中氨基酸的含量测定，样品均经冷冻干燥(冷冻干燥机，日本，FDU-1100)24 h后，采用全自动氨基酸分析仪(日本，日立L-8900型)测得。

表2 实验饲料氨基酸组成(%干物质)

1.5.2 血清和肝胰脏非特异性免疫相关酶活性的测定

从-80℃超低温冰箱中取出肝胰脏样品，转移到4℃冰箱中，待其解冻后备用。准确称量肝胰脏0.5 g，然后按1∶10的质量体积比加入预冷的生理盐水，在冰浴条件下，用匀浆器匀浆，将匀浆液在4℃下3 000 r/min离心10 min所得上清液即为粗酶液，并于24 h内测定。血清和肝胰脏中的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)活性和肝脏蛋白浓度均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒(酶标仪，瑞士，Tecan Infinite M200)检测，总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化物酶(POD)和溶菌酶(LZM)活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒通过分光光度计检测。

1.5.3 计算及统计分析方法

对虾的存活率、增重率、特定生长率、摄食率、饲料效率、蛋白效率比、蛋白质沉积率参考以下公式：

式中：N0、Nt——分别为初始和死亡的对虾尾数；

W、W0、Wt——分别为每尾虾摄食的饲料干物质重(g)、实验开始时对虾的体重(g)和实验结束时对虾的体重(g)；

P、P0、Pt——分别表示饲料粗蛋白含量(干重%)、实验开始时虾体粗蛋白含量(湿重%)和实验结束时虾体粗蛋白含量(湿重%)；

t——养殖实验天数(d)。

各组试验数据，均采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，若差异显著进行邓肯氏多重比较(Duncan's multiple range tests)，P＜0.05被认为差异显著，所有数据均以“平均值±标准误(Mean±SE)”表示。

2 结果

2.1 不同来源蛋白水解物对凡纳滨对虾生长和饲料利用的影响（见表3）

表3 不同来源蛋白水解物对凡纳滨对虾生长和饲料利用的影响(平均值±标准误)

由表3可知，各处理组实验鱼存活率为93.33%～96.67%之间，没有显著性差异(P＞0.05)；FPH组和FM组的末重和特定生长率最高，两组之间没有显著差异(P＞0.05)，但显著高于PBPH组、SPH组和YPH组(P＜0.05)；FPH组和FM组的摄食率显著低于PBPH组和SPH组(P＜0.05)，但与 YPH组无显著性差异(P＞0.05)；饲料效率和蛋白效率比在各处理间的趋势相同，即在FPH组与FM组显著高于PBPH组和SPH组(P＜0.05)，但与YPH组无显著差异 (P＞0.05)；FPH组、FM组和YPH组的蛋白质沉积率没有显著性差异(P＞0.05)，但FPH组与FM组显著高于SPH组(P＜0.05)。

2.2 不同来源蛋白水解物对凡纳滨对虾体组成的影响（见表4）

表4 不同来源蛋白水解物对凡纳滨对虾体组成的影响(平均值±标准误)(%)

由表4可知，凡纳滨对虾虾体干物质含量范围在22.26%～22.83%之间，粗蛋白含量范围在78.73%～80.74%之间，粗脂肪含量范围在3.55%～3.77%之间，灰分含量范围在11.63%～13.04%之间。各处理组虾体中干物质和灰分含量没有显著性差异(P＞0.05)；FPH组、FM组、YPH组和PBPH组的粗蛋白含量没有显著差异(P＞0.05)，但FM组显著高于SPH组(P＜0.05)；FPH组和FM组粗脂肪含量显著高于YPH组和SPH组(P＜0.05)，但FPH组与PBPH组无显著差异(P＞0.05)。

2.3 不同来源蛋白水解物对凡纳滨对虾血清和肝胰脏非特异性免疫的影响（见表5）

由表5可知，在血清中，碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和一氧化氮合酶活性FPH组显著高于FM组(P＜0.05)，FPH组和YPH组显著高于SPH组(P＜0.05)；超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性FPH组和YPH组高于FM组，但没有显著性差异(P＞0.05)，FPH组和YPH组显著高于SPH组(P＜0.05)；溶菌酶FPH组和YPH组高于FM组，但没有显著性差异(P＞0.05)，FPH组和YPH组显著高于PBPH组和SPH组(P＜0.05)；总抗氧化能力FPH组显著高于FM组(P＜0.05)，FPH组和YPH组显著高于PBPH组和SPH组(P＜0.05)。在肝胰脏中，碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性FPH组和YPH组高于FM组，但没有显著性差异(P＞0.05)，FPH组和YPH组显著高于PBPH组和SPH组(P＜0.05)；酸性磷酸酶活性FPH组和YPH组高于FM组，但没有显著性差异(P＞0.05)，FPH组和YPH组显著高于SPH组(P＜0.05)；溶菌酶活性FPH组显著高于FM组(P＜0.05)，FPH组和YPH组显著高于PBPH和SPH组(P＜0.05)；总抗氧化能力FPH组显著高于FM组(P＜0.05)，FPH组和YPH组显著高于SPH组(P＜0.05)；过氧化物酶活性FPH组和YPH组高于FM组，但没有显著性差异(P＞0.05)，FPH组和YPH组显著高于PBPH组和SPH组(P＜0.05)。

表5 不同来源蛋白水解物对凡纳滨对虾血清和肝胰脏中免疫相关酶活性的影响(平均值±标准误)

3 讨论

3.1 不同来源蛋白水解物对凡纳滨对虾生长和饲料利用的影响

实验结果表明，在生长方面，添加鱼蛋白水解物的FPH组末期均重和特定生长率与以鱼粉为唯一蛋白源的FM组无显著性差异(P＞0.05)，添加PBPH、SPH和YPH组的末期均重和特定生长率显著低于FM组(P＜0.05)；在饲料利用方面，添加鱼蛋白水解物的FPH组和添加酵母蛋白水解物的YPH组与FM组在摄食率、饲料效率、蛋白效率比和蛋白质沉积率方面均没有显著性差异(P＞0.05)。研究发现，相比YPH和PBPH，FPH更有利于金头鲷(Sparus aurata)和欧洲鲈鱼(Dicentrarchus labrax)幼鱼的生长[4-5]，这与本实验研究结果是基本一致，添加鱼蛋白水解物和酵母蛋白水解物组的饲料利用效果要优于添加猪血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物组。Gisbert等(2012)指出，酵母蛋白水解物和猪血蛋白水解物有可能替代鱼蛋白水解物来制作海洋仔稚鱼饲料[4]。在本实验中，猪血蛋白水解物、豆粕蛋白水解物的生长和饲料利用效果不如鱼蛋白水解物与酵母蛋白水解物，推测影响对虾生长和饲料利用效果的主要原因是氨基酸平衡被破坏，“水桶效应”产生，导致生长缓慢，蛋白效率比降低，蛋白源缺乏某种或某些必需氨基酸，会产生对生长的抑制作用[14-16]。凡纳滨幼虾对饲料中氨基酸的的需求量分别为1.51%苏氨酸、2.05%赖氨酸、0.89%蛋氨酸、2.16%精氨酸[17-19]；实验饲料氨基酸含量经检测，FPH中含1.45%苏氨酸，PBPH中含0.64%蛋氨酸、1.99%精氨酸，SPH中含1.39%苏氨酸、0.66%蛋氨酸、1.73%赖氨酸，YPH中含0.70%蛋氨酸、1.83%赖氨酸，其氨基酸含量均低于对虾实际需求量。

3.2 不同来源蛋白水解物对凡纳滨对虾血清和肝胰脏非特异性免疫的影响

实验结果证明，在血清和肝胰脏中，添加鱼蛋白水解物和酵母蛋白水解物组的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、一氧化氮合酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力要优于添加猪血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物组。研究发现，饲料中添加5%鱼蛋白水解物替代鱼粉时，中国对虾(Penaeus chinensis)肝胰脏中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活性显著高于其他组(P＜0.05)[20]，饲料中添加2%酵母蛋白水解物替代鱼粉时，试验组大菱鲆幼鱼血清溶菌酶、肝脏酸性磷酸酶、一氧化氮合酶及肝脏超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)[13]，这与本实验结果是基本一致的。本实验中鱼蛋白水解物和酵母蛋白水解物在免疫相关酶活性和抗氧化能力方面效果要优于猪血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物，推测可能与水解过程中产生的活性小肽有关，其具有抗氧化性、增强免疫力等生理功能[7]；水解过程中产生的生物活性肽具有免疫增强和抗菌性，其对提高大西洋鳕鱼(Gadus morhua)鱼苗的非特异性免疫有一定作用[21,6]；YPH在一定程度上能提高对虾的免疫能力，除了生物活性肽影响之外，核苷酸和B族维生素也具有提高机体免疫力和抗氧化能力的作用[22-24]。许丹丹等研究表明，饲料中添加核苷酸混合物可显著提高凡纳滨对虾肝胰腺碱性磷酸酶活性[23]。周小秋指出，B族维生素可以通过提高血清溶菌酶和酸性磷酸酶活性增强杀菌能力[24]。本实验中，添加猪血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、一氧化氮合酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力低于添加鱼蛋白水解物和酵母蛋白水解物组，推测因其生长不理想从而抑制了非特异性免疫的表达效果。研究表明，猪血水解获得猪血多肽或游离氨基酸，猪血多肽具有抗氧化性、增强免疫功能活性等功能[25]。周学文发现酶解猪血粉可以增强肉鸡抗病能力[26]，豆粕经酶解获得多肽及游离氨基酸等蛋白消化产物，同时大豆多肽可以增强水产动物免疫力，具体表现在提高其存活率及调节动物免疫系统的功能[27-28]。