抗疏健骨颗粒水提工艺研究

杜星，郭东艳，史传道，王露，曹瑞

(陕西中医学院，陕西 咸阳 712046)

摘要：目的优化抗疏健骨颗粒水提工艺条件，为抗疏健骨颗粒剂的进一步研究奠定基础。方法以β-蜕皮甾酮含量及出膏率为评价指标，在单因素实验的基础上，通过正交试验筛选抗疏健骨颗粒最佳水提工艺。结果影响水提工艺各因素的作用主次为:C提取次数>B提取时间>A溶剂用量，最佳提取工艺条件是A2B2C3，即用10倍量水，提取3次,每次90 min。结论通过单因素试验、正交试验设计优选得到的抗疏健骨颗粒中牛膝、白术2味药材的水提工艺条件稳定可行。

关键词：抗疏健骨颗粒；β-蜕皮甾酮；正交设计；提取工艺

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.01.022

中图分类号：R284.2文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)01-0074-03

基金项目:陕西省科技厅资助项目(2012KTCL03-22)。

作者简介:杜星(1988-)，女，硕士研究生，主要从事中药新制剂与新剂型研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-08-06)

Study on the process of water extraction for Kangshu Jiangu Granules

DU Xing,GUO Dongyan,SHI Chuandao,WANG Lu,CAO Rui

(Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,Shanxi Provincce,China)

Abstract：ObjectiveTo optimize water extraction method for Kangshu Jiangu Granules and lay a solid foundation for its further study.MethodsThe extracting method of Kangshu Jiangu Granule was optimized by orthogonal design,taking the extraction rate of β-ecdysterone and extract yield as indexes.ResultsThe factors that influence water extraction:C extraction times>B extraction time>A solvent consumption.The optimum extracting condition was A2B2C3:with the volume of 10 folds,extracting for 3 times,90mins one time.ConclusionThe optimum technology is stable and feasible for the extraction of Kangshu Jiangu Granules by orthogonal and single factor experiment.

Keywords:Kangshu Jiangu Granules;β-ecdysterone;orthogonal design;extraction process

抗疏健骨颗粒由淫羊藿、杜仲、牛膝、白术、丹参等药物组成，具有补肾健脾、活血壮骨之功，主要用于脾肾两虚、气血瘀阻导致的骨质疏松症。牛膝是我国常用中药材之一，具有补肝肾、强筋骨、通淋利尿、引血下行之功[1]。目前发现牛膝中的活性成分主要为皂苷、植物甾酮、多糖以及黄酮类和生物碱类物质[2]。现代药理学研究表明，牛膝具有免疫调节、抗炎、抗菌、子宫兴奋、抗骨质疏松等多种作用[3-6]。白术主要含挥发油、白术内酯、白术多糖、苷类、氨基酸等成分，挥发油中的白术内酯类成分是白术中比较有特征的成分，也是重要的活性成分[7]，另外苍术酮不稳定，在空气中易氧化[8]。白术具有健脾益气、调节胃肠功能、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、延缓肾脏衰老等作用[9-11]。结合2味药材所含化学成分的理化性质及现代药理研究结果，本实验拟在单因素实验的基础上，以β-蜕皮甾酮含量及出膏率为评价指标，采用4因素3水平的L9(34)正交实验设计对水提工艺进行优化，为抗疏健骨颗粒的进一步研究提供参考依据。

1实验材料

1.1材料牛膝(批号：130401)、白术(批号：121201)均购于西安盛兴中药饮片有限责任公司，β-蜕皮甾酮对照品(供含量测定用，批号:111638-200603，中国药品生物制品检定所)，乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯(Honeywell)，水为过滤后的娃哈哈纯净水。

1.2仪器安捷伦1260型高效液相色谱仪(G1329B型进样器,G1311C型四元泵，G4212B型二极管阵列检测器，ChemStation for LC 3D systems)。METTLER TOLEDO(AL204)电子天平(万分之一)，Sartorius MC电子天平(十万分之一)。D101型电热鼓风干燥箱。

2方法与结果

2.1浸泡时间及吸水率的考察按处方比例称取牛膝、白术，共54 g,加5倍量水进行浸泡，至药物完全浸透，滤去多余水分，药渣称重，记录药材吸水后的重量，计算吸水率。

表1　药材吸水率试验结果( n=3)

结果表明，药材的吸水率为71.4%，即在首次加水时应多加1.0倍量。

2.2β-蜕皮甾酮含量测定

2.2.1色谱条件Thermo ODSC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈-水-甲酸(16∶84∶0.1)，流速1.0 mL/min，检测波长250 nm，柱温为室温。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取β-蜕皮甾酮对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3供试品溶液制备精密移取各样品液10 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4标准曲线的绘制分别精密吸取β-蜕皮甾酮对照品溶液(浓度0.1 mg/mL)1,2,4，6，8，10，12 μL，按上述色谱条件注入色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，β-蜕皮甾酮含量(μg)为横坐标绘制标准曲线。计算的回归方程为：Y=1 668.2X+104.16，相关系数R2=0.999 9,β-蜕皮甾酮在0.1～1.2 μg之间线性关系良好。

2.2.5样品测定精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10 μL，依据2.2.1项下色谱条件进行测定。

2.3出膏率的测定精密吸取各浓缩定容至100 mL的样品液10 mL,置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱内干燥至恒重，至干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量。按下式计算出膏率。出膏率=[(浸膏重量×10)/药材重量]×100%

2.4单因素试验

2.4.1提取时间考察按处方比例称取牛膝、白术5份，每份54 g，分别加10倍量水煎煮1次，每次30，60，90，120，150 min，滤过，浓缩，定容至100 mL量瓶中。结果见表2。

表2　不同提取时间考察结果

2.4.2加水量考察按处方比例称取牛膝、白术6份，每份54 g，分别加6，8，10，12，14，16倍量水，煎煮2次,每次90 min，滤过，合并滤液，浓缩，定容至100 mL量瓶中。结果见表3。

表3　不同加水量考察结果

2.4.3提取次数考察按处方比例称取牛膝、白术4份，每份54 g，加10倍量水分别提取1,2，3，4次，每次90 min，滤过，浓缩，分别定容至100 mL量瓶中。结果见表4。β-蜕皮甾酮含量在第1次时为57.94 μg/mL，第2次为16.58 μg/mL，第3次为6.31 μg/mL。由此可以看出，提取3次时已基本提取完全。

2.5正交试验优选最佳水提工艺

2.5.1试验设计及结果[12-15]参照单因素设计试验

表4　不同提取次数考察结果

结果，选择加水量，提取时间，提取次数3个因素，每个因素选择3个水平，按L9(34)正交表进行试验，以出膏率、β-蜕皮甾酮含量的加和为综合指标筛选最佳提取工艺参数。因素水平表见表5。

表5　因素水平

2.5.1.1试验方法按处方比例称取牛膝、白术9份，每份54 g,按照正交试验因素水平表安排用L9(34)正交表进行提取，滤过，滤液浓缩并定容至100 mL量瓶中，备用。

2.5.1.2出膏率测定精密移取10 mL样品液至已干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥12 h，置干燥器中冷却30 min，迅速称重。按下式计算出膏率，结果见表6。出膏率=[浸膏重量×10/药材重量]×100%。

2.5.1.3β-蜕皮甾酮含量测定按单因素项下供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算β-蜕皮甾酮含量，结果见表6,方差分析结果见表7。综合评分(OD)=0.4W1/Wmax1+0.6W2/Wmax2

表6　正交试验设计与结果

表7　正交试验方差分析

以综合评分为考察指标，由表6中极差R值大小显示，各因素的作用主次为C(提取次数)>B(提取时间)>A(溶剂用量)。表7方差分析结果表明：C因素各水平之间差异具有显著性(P<0.05),A、B因素各水平之间差异无显著性(P>0.05)。综上所述最终提取工艺确定为：A2B2C3，即10倍量水提取3次，每次90 min。

2.5.2验证试验为了考察正交试验的结果是否具有重现性,进行验证实验。称取以上2味药材3份，每份108 g，按照优选的工艺条件进行提取，测定出膏率、β-蜕皮甾酮含量，结果见表8。

表8　验证实验结果

验证试验结果表明：该工艺条件合理可行，具重现性。

3讨论

牛膝是一味补骨中药，现代药理研究结果表明，含牛膝的补骨中药组方可减轻大鼠子宫重量，增加骨小梁密度、面积、总体积及密质骨面积，减小骨髓腔面积[16]，从牛膝中提取的甾酮成分具有明显的促进促成骨细胞增长的活性[17]，考虑到甾酮类成分为牛膝中的主要活性成分，因此在工艺筛选中以β-蜕皮甾酮含量作为评价指标之一。笔者曾对白术中所含挥发油的含量进行了预实验研究，结果表明，白术中的挥发油含量过于偏低，采用水蒸汽蒸馏法提取白术挥发油，出油率仅为0.2%。有文献报道白术水煎液可明显促进骨髓细胞增殖，增强机体免疫力[18]，综合考虑到大生产及节约成本，本方中的白术考虑舍弃提取挥发油，直接水煎煮提取白术中的活性成分，并以出膏率作为评价指标之一。

本试验建立了β-蜕皮甾酮含量及出膏率的测定方法。通过正交设计试验法优选所得的最佳提取工艺为10倍量水提取3次，每次90min，验证试验结果表明，该工艺条件合理可行，重现性较好。

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