■陈飞暴 宁司滨 姜晨

（大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连 116023）

随着现代水产养殖业和水产饲料工业的发展，人们对鱼类的营养需要及其饲料配方进行了许多研究。同时，鱼类饲料与消化酶之间的关系也引起了鱼类生物学家的关注。鱼类消化酶活性的高低直接关系到鱼类对饲料中营养物质的吸收和利用，从而影响到鱼类的生长和发育。

鉴于大泷六线鱼具有重要的经济价值和广阔的开发前景，而目前对其消化酶活性方面的研究较少，特别是酸碱度对消化酶活性的影响还未见报道。本文设置了10个pH值梯度，以研究不同pH值对大泷六线鱼不同组织（胃、盲囊、前肠、后肠、肝胰脏）的主要消化酶（蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶）的影响，为大泷六线鱼人工饵料中添加促进胃液分泌的添加剂的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的大泷六线鱼捕自大连海区，共120尾，大小基本一致，无病无伤，体质健康。鱼体重120～145 g。取样前先将试验鱼饥饿24 h，解剖过程在冰盘上进行，取出胃、盲囊、肝胰脏、前肠和后肠并剥除多余脂肪和组织，用精密pH试纸测定各组织的酸碱度。测定结束后，用去离子水清洗组织内容物并用滤纸吸干水分，然后称重记录。之后将组织剪碎进行匀浆，再将匀浆液在4℃冰箱内静置1 h，然后用冷冻离心机离心20 min，转速为6 000 r/min，取上清液于4℃冰箱内保存备用。

1.2 实验设计

实验为测定pH值对大泷六线鱼胃、盲囊、前肠、后肠及肝胰脏的主要消化酶活性（包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶）的影响，共设计了10个不同的pH值梯度值，每个pH值设置3个重复。胃蛋白酶pH值设定范围是2.0～7.4，每两个pH值差值为0.6；盲囊、前肠、后肠及肝胰脏蛋白酶的pH值设定范围是6.4～10.0，每两个pH值差值为0.4。胃淀粉酶pH值设定范围是2.2～7.6，每两个pH值差值为0.6；盲囊、前肠、后肠及肝胰脏淀粉酶的pH值设定范围是5.2～8.8，每两个pH值差值为0.4。胃脂肪酶pH值设定范围是2.6～8.0，每两个pH值差值为0.6；盲囊、前肠、后肠及肝胰脏脂肪酶的pH值设定范围是6.4～10.0，每两个pH值差值为0.4。

1.3 实验方法

蛋白酶活性测定采用福林-酚法。蛋白酶的定义为：在37℃下每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸定义为一个酶活力单位。蛋白酶活力单位=A/15×F；其中A为标准曲线下，样品测得的光密度所对应的酪氨酸微克数；F为酶液的最终稀释倍数；反应时间15 min。

淀粉酶活性测定采用淀粉-碘显色法。淀粉酶定义为：在37℃下，30 min内，100 ml酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10 mg时称为一个淀粉酶单位。淀粉酶活力单位/100 ml=（对照管光密度-测定管光密度）/对照管光密度×800。

脂肪酶活性测定采用滴定法，以聚乙烯醇（P.V P.）橄榄油乳化液为反应底物。脂肪酶的定义为：在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1μg分子脂肪酸的酶量定为一个国际单位。脂肪酶活力单位=（A-B）N·f/t，其中A为样品消耗碱液的体积数（ml），B为对照组消耗碱液的体积数（ml），N为每毫升碱液微克分子数，f为稀释倍数，t为作用时间（min）。

蛋白质浓度的测定采用考马司亮蓝结合法，牛血清白蛋白为标准蛋白。

比活力定义为：每毫克（克）酶蛋白含多少酶活力单位。

1.4 实验数据处理及分析

实验数据用SPSS13.0软件进行处理分析，并用Duncan's法进行多重比较，数据用“Mean±SE”的形式表示。使用Excel2003软件进行图表制作。

2 实验结果

2.1 不同pH值对大泷六线鱼蛋白酶比活力的影响（见表1）

表1 不同pH值对大泷六线鱼蛋白酶比活力的影响（U/mg）

大泷六线鱼不同组织的蛋白酶比活力都随着pH值的增加呈先升高后降低的趋势。胃蛋白酶在pH值为2.6时活性最强，且显著高于其它pH值对应的胃蛋白酶活性（P＜0.05）；盲囊蛋白酶在pH值为8.8时活性最强，但与其它pH值对应的盲囊蛋白酶活性相比较并无显著性差异（P＞0.05）；前肠蛋白酶在pH值为8.4时活性最强，且显著高于pH为6.4和pH值为10.0时的前肠蛋白酶活性（P＜0.05）；后肠蛋白酶在pH值为8.8时活性最强，但只对pH值为6.4的后肠蛋白酶表现出显著性差异，对于其它pH值对应的后肠蛋白酶活性并不表现显著性差异（P＞0.05）；肝胰脏蛋白酶在pH值为7.6时酶比活力最高，与其它pH值条件下对应的肝胰脏蛋白酶活性差异不显著（P＞0.05）。由此，大泷六线鱼胃、盲囊、前肠、后肠及肝胰脏的蛋白酶比活力最适pH值分别为2.6、8.8、8.4、8.8、7.6。在最适pH值条件下，蛋白酶比活力的排序为：胃＞盲囊＞肝胰脏＞前肠＞后肠。

2.2 不同pH值对大泷六线鱼淀粉酶比活力的影响（见表2）

表2 不同pH值对大泷六线鱼淀粉酶比活力的影响（U/g）

大泷六线鱼各组织的淀粉酶活性均随pH值的增加呈现先升高后降低的趋势，这一趋势与蛋白酶相似。胃淀粉酶在pH值为5.8时活性最强，且显著高于其他pH值对应的淀粉酶活性（P＜0.05）。盲囊淀粉酶在pH值为7.6时活性最强，且显著高于除pH值为8.0之外的其它各组的淀粉酶活性（P＜0.05）。前肠淀粉酶在pH值为8.4时活性最强，与其它pH值相对应的前肠淀粉酶活性相比较，呈显著性差异（P＜0.05）。后肠淀粉酶与前肠淀粉酶相似，都表现在pH值为8.4时活性最强，且显著高于其它各pH值条件下的后肠淀粉酶活性（P＜0.05）。肝胰脏淀粉酶在pH值为8.0时活性最强，与其它pH值条件下对应的肝胰脏淀粉酶活性相比较，表现显著性差异（P＜0.05）。由此，大泷六线鱼胃、盲囊、前肠、后肠及肝胰脏的淀粉酶活性最适pH值分别为5.8、7.6、8.4、8.4、8.0。在最适pH值条件下，淀粉酶活性的排序为：盲囊＞胃＞前肠＞后肠＞肝胰脏，但各组织之间淀粉酶活性的差异并不显著。

2.3 不同pH值对大泷六线鱼脂肪酶比活力的影响（见表3）

大泷六线鱼各试验组织的脂肪酶活性随pH值的增高均呈现先升高后降低的趋势，这与蛋白酶和脂肪酶的测定结果相似。胃脂肪酶在pH值为7.4时活性最强，且显著高于其它各pH值条件下的胃脂肪酶活性（P＜0.05）。盲囊脂肪酶在pH值为8.0时酶活性最强，相比于其他各pH值条件下的盲囊脂肪酶有显著性差异（P＜0.05）。前肠脂肪酶在pH值为8.4时酶活性最强，且与其它各pH值条件下的前肠脂肪酶活性相比，差异显著（P＜0.05）。后肠脂肪酶也表现在pH值为8.4时酶活性最强，且显著高于除pH值为8.0之外的其它各pH值条件下的后肠脂肪酶活性 （P＜0.05）。肝胰脏脂肪酶在pH值为7.6时活性最强，且与pH值在6.8～8.0之间的各组酶比活力差异不显著（P＞0.05），但显著高于其它各pH值梯度下的肝胰脏脂肪酶活性（P＜0.05）。由此，大泷六线鱼胃、盲囊、前肠、后肠及肝胰脏的脂肪酶比活力最适pH值分别为7.4、8.0、8.4、8.4、7.6。在最适pH值条件下，脂肪酶活性排序为：盲囊＞肝胰脏＞前肠＞后肠＞胃。

表3 不同pH值对大泷六线鱼脂肪酶比活力的影响（U/mg）

3 讨论

3.1 食性与消化酶

鱼类的食性与消化酶之间关系密切。Agrawal等（1975）[1]比较了不同食性鱼类的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的差异，在肉食性、杂食性和草食性鱼类中，肉食性鱼的蛋白酶和脂肪酶活性相对较高，而草食性鱼类的淀粉酶活性较高，杂食性鱼类的消化酶活性则介于二者之间。吴婷婷等（1994）[2]在对鳜、鲤、鲢、鲫、青鱼和草鱼的研究中同样发现了这一相关性，蛋白酶的活性在不同食性的鱼类中存在差异，在肉食性鱼类、杂食性鱼类、滤食性鱼类和草食性鱼类中表现为活性逐渐降低。从实验结果来看，在适宜的pH值条件下，大泷六线鱼的淀粉酶活性较弱，脂肪酶活性次之，蛋白酶活性最高。这一结果恰与其食性相吻合，大泷六线鱼属近海底栖肉食性鱼类，主食鱼类、甲壳类和多毛类等底栖动物，这也进一步说明了食性与消化酶之间相一致的观点。不同食性的鱼类之所以表现出不同的消化酶活性，主要是因为消化部位的结构的不同，不同组织结构具有不同的消化机能，从而引起消化酶的活性具有明显的差异。肉食性鱼类多以高蛋白含量的水生动物为食，且肠道较短，需要具有较高的蛋白酶活性才能在有效的时间内使食物得到充分消化，而草食性鱼类肠道较长，食物在消化道内停留时间长，可以弥补蛋白酶活性低的不足，这也是鱼类对其生态环境的一种适应性表现。

3.2 pH值对消化酶活性的影响

从实验的结果看，大泷六线鱼的各组织的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均随着pH值的增加，表现为先升高再降低。消化酶活性之所以会随着反应pH值的不同而发生改变，其一是pH值能使消化酶的活性中心或与之相关基团的解离状态发生改变，从而影响底物与消化酶的结合，改变消化酶的活性；其二是当pH值超过一定范围时，会使消化酶的构象发生改变，导致消化酶变性失活（姜令绪等，2007）[3]。

3.2.1 pH值对鱼类蛋白酶活性的影响

本研究表明大泷六线鱼胃、盲囊、前肠、后肠和肝胰脏的蛋白酶活性随着pH值的变化，其活性均发生变化，并在一定的pH值下达到最大值，即各类消化酶均存在着适宜的pH值，而且不同消化部位的蛋白酶，其适宜的pH值水平不同。在实验中，胃、盲囊、前肠、后肠和肝胰脏的蛋白酶比活力最适pH值分别为2.6、8.8、8.4、8.8、7.6。在最适pH值条件下，胃和盲囊的蛋白酶比活力明显高于其他组织，因此可以认为大泷六线鱼的胃和盲囊为消化蛋白质的主要部位。

周景祥等（2001）[4]研究指出，有胃硬骨鱼类胃蛋白酶的最适pH值在2.0～3.0之间，肠道蛋白酶的最适pH值在6.5～9.5之间，肝胰脏蛋白酶的最适pH值在7.0～8.7；李文雯等（2012）[5]报道星突江鲽胃、肠和肝胰腺蛋白酶活性的最适pH值分别为3.8、8.2和7.8；范镇明等（2008）[6]研究结果表明，河鲈胃、肠和肝胰脏的蛋白酶最适pH值分别为2.0、8.0和6.0；区又君等（2010）[7]研究发现卵形鲳鲹幼鱼的胃蛋白酶最适pH值为2.2，成鱼为3.2，幼鱼的肝、肠和幽门盲囊的蛋白酶活性最适pH值为7.2，而成鱼为8.0；沈文英等（2006）[8]报道澳洲宝石鱼肠道、肝胰脏蛋白酶的最适pH值分别为7.0～7.5、7.5，胃蛋白酶的最适pH值为2.0。还有一些关于鱼类肠道蛋白酶的最适pH值的报道，如黄鳝的适宜pH 值为 8.0～9.5（杨代勤等，2005）[9]，鲑鱼（Salmo salar）为 9.2（W.Uys等，1987）[10]，大菱鲆（ScopHthalmus maximus）为 9.0（Munilla-Moran R 等，1996）[11]，以上的研究结果与本实验的检测结果较为一致，即胃蛋白酶的最适pH值在酸性范围，消化道其它部位的蛋白酶最适pH值均在中性至偏碱性范围。

另有文献认为，有胃鱼类胃蛋白酶在强酸性条件下活性较强，在中性环境（pH值7.0）则失活（区又君等，2010；尾崎久雄，1983）[12-13]。本实验中，当pH值升至7.4时，胃蛋白酶活性接近零，认为基本失活，这与上述观点一致。可以认为胃进行的蛋白消化是在酸性条件下进行的，在中性至碱性条件下不具备消化蛋白的能力。

3.2.2 pH值对鱼类淀粉酶活性的影响

大泷六线鱼消化道各部位淀粉酶活性随着pH值的升高，呈现先升高再降低的趋势，胃、盲囊、前肠、后肠及肝胰脏的淀粉酶比活力最适pH值分别为5.8、7.6、8.4、8.4、8.0。其中胃最适pH值偏酸性，其它部位偏碱性。在最适pH值条件下，各组织的淀粉酶的酶比活力差异较小，认为大泷六线鱼各消化器官均具备一定的淀粉消化能力。

关于鱼类淀粉酶的最适pH值研究，国内外有很多报道。周景祥等（2001）[4]报道了有胃硬骨鱼类肝胰脏、肠和胃淀粉酶的最适pH值分别是6.8～7.0、5.0～8.0和5.0～7.0；梅景良等（2004）[14]报道了黑鲷胃、肝胰脏和肠淀粉酶的最适pH值分别是5.0、7.0和7.0；沈文英等（2006）[8]报道了澳洲宝石鱼肝胰脏、肠道、胃淀粉酶的最适pH值均为6.2；尾崎久雄（1983）[13]报道了狭鳕（Theragra chalcogramma）幽门盲囊和肠的淀粉酶最适pH值为7.0；李文雯等（2012）[5]报道星突江鲽胃、肠和肝胰腺淀粉酶活性的最适pH值分别为6.6、7.4和7.0；杨代勤等（2005）[9]报道了黄鳝肠道淀粉酶的适宜pH值为7.0～8.0；陈健等（2015）[15]研究结果表明不同日龄的蓝点马鲛鱼淀粉酶最适pH值不同，1日龄仔鱼淀粉酶最适pH值为7,7日龄仔鱼pH值为7～7.5，15日龄仔鱼 pH值为 7.5；杨元昊等（2006）[16]研究表明兰州鲇的胃、肝胰脏和肠淀粉酶最适pH值分别为5.4、6.6和7.0；另有研究表明斑点叉尾鮰胃、肠和肝胰脏淀粉酶的最适pH值分别为5.5、7.5和6.5（宋威等，2010）[17]。以上各研究结果表明鱼类消化道淀粉酶的最适pH值不尽相同，这可能是由于不同种类、不同消化部位酶活性中心存在差异，致使酶活力表达的最适pH值有所不同。但总的来说淀粉酶活性的最适pH值均控制在弱酸性到中性偏碱性范围内。

3.2.3 pH值对鱼类脂肪酶活性的影响

大泷六线鱼消化道各部位脂肪酶活性随着pH值的升高，均呈现先升高再降低的趋势，胃、盲囊、前肠、后肠及肝胰脏脂肪酶最适pH值分别为7.4、8.0、8.4、8.4、7.6。在最适pH值条件下，胃的脂肪酶活性最低，但盲囊的脂肪酶活性明显高于其它组织。可以认为大泷六线鱼的盲囊是进行脂肪消化的最主要场所，其它消化部位起到辅助消化脂肪的作用。范镇明等（2008）[6]研究结果表明，河鲈胃、肠和肝胰脏的脂肪酶最适pH值分别为6.0、3.0和4.0；李文雯等（2012）[5]报道星突江鲽胃、肠和肝胰腺脂肪酶活性的最适pH值分别为 7.4、7.8 和 7.8；伍莉等（2002）[18]研究表明黄鳝前、中、后肠和肝胰脏中脂肪酶活力的最适pH值均为7.2，杨代勤等（2005）[9]对黄鳝的研究表明黄鳝脂肪酶的适宜pH值为7.0～7.5，二者相符。以上研究结果表明，胃脂肪酶最适pH值在偏酸或中性偏碱性范围内；肠等消化部位脂肪酶最适pH值一般在中性偏碱性范围内。实验结果表明，大泷六线鱼消化道各部位脂肪酶的最适pH值均在弱碱性范围，与上述结论基本一致。

3.3 消化道不同部位消化酶活性差异

在实验中，大泷六线鱼的消化道各部位的蛋白酶在最适pH值条件下，不同组织的蛋白酶活性的排序为：胃＞盲囊＞肝胰脏＞前肠＞后肠，由此可见，胃的蛋白酶活性最强，因此，可以认为大泷六线鱼的胃是蛋白质消化的最初也是最主要的场所，且实验中检测到胃液在正常情况下呈酸性，极有利于其蛋白酶活性的发挥。而紧接着胃的消化部位的盲囊也具有较高的蛋白酶活性，能够对蛋白质进一步消化，提高鱼体消化吸收蛋白质的能力。

在各部位淀粉酶的最适pH值条件下，淀粉酶活性排序为：盲囊＞胃＞前肠＞后肠＞肝胰脏，但各组织之间淀粉酶活性差异不显著（P＞0.05）。认为大泷六线鱼各消化部位均具备一定的淀粉消化能力，但各部位淀粉酶比活力均不高，这是与其食性相适应的表现。

在各部位脂肪酶的最适pH值条件下，脂肪酶活性的排序为：盲囊＞肝胰脏＞前肠＞后肠＞胃，盲囊的脂肪酶活性最强，可以认为盲囊为大泷六线鱼进行脂肪消化的主要部位。Das等（1991）[19]认为，鱼类肝胰脏是生成脂肪酶的主要部位,且消化系统的各个部分均存在脂肪酶的活动。在实验中测得的肝胰脏脂肪酶活性显著低于盲囊，稍高于肠，可能是由于肝胰脏中的脂肪酶多是以无活性的酶原存在，所以检测到的脂肪酶活性不太高。从实验结果来看，大泷六线鱼幽门盲囊是进行脂肪消化的最主要场所，其它消化部位起到辅助消化脂肪的作用，胃是消化脂肪水平最低的消化部位。

实验还检测到盲囊、肠和肝胰脏中消化液均为中性偏弱碱性，且受消化道中食物有无的影响较小。而从实验结果来看，大泷六线鱼上述各消化部位主要消化酶的最适pH值也在中性偏碱性范围内，认为大泷六线鱼消化道pH值较有利于各部位消化酶活性的发挥，有效促进对食物的消化和吸收。

另外，从实验结果不难看出，大泷六线鱼消化道的前段对食物的消化起主导作用，尤其是盲囊的消化能力不容忽视。对于蛋白质的消化，胃最强，盲囊次之；对于脂肪的消化，盲囊的酶活性显著高于其它部位；对于淀粉的消化，各部位差异不显著，但盲囊的淀粉酶活性依然高于其它部位。可见，盲囊是大泷六线鱼消化的中枢部位。