沙格列汀抑制NF-κB信号通路下调LPS诱导的人肾小管上皮HK-2细胞MCP-1的表达*

李清福1夏缨2李晓艳1何彦蓉1张维3李露4

(成都军区机关医院 1.内分泌科; 2.第二门诊部, 四川 成都 610000;3.成都医学院第一附属医院， 四川 成都 610500;

4.四川大学华西医院，四川 成都 610041)

【摘要】目的探讨二肽基肽酶4(DPP-4)竞争性抑制剂沙格列汀(saxagliptin)对脂多糖(LPS)诱导状态下人肾小管上皮HK-2细胞MCP-1表达的调节作用及相关的分子机制。方法将人肾小管上皮细胞HK-2细胞分为3组，分别为对照组(Control组)、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX组)和LPS组。在干预12小时后使用RT-PCR法和western blot法对HK-2细胞MCP-1 mRNA和蛋白的表达水平进行检测；并使用western blot法对HK-2细胞NF-κB p65活化水平(phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)进行分析。结果与Control组相比较，在LPS干预12小时后 HK-2细胞MCP-1 mRNA和蛋白的表达水平以及phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；但LPS组较LPS+SAX组MCP-1 mRNA和蛋白的表达的升高以及phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值的增加更加显著，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论DPP-4抑制剂沙格列汀可以通过抑制NF-κB的磷酸化下调LPS诱导的人肾小管上皮HK-2细胞MCP-1合成和释放并对其产生保护作用。

【关键词】沙格列汀； HK-2细胞； 单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)； 核转录因子-κB (NF-κB)

【中图分类号】R 446

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.005

Abstract【】ObjectiveTo explore whether saxagliptin could down-regulate LPS-induced MCP-1 expression in human proximal tubular epithelial cells, and its potential molecular mechanism. MethodsHuman proximal tubular epithelial cells (HK-2 cells) were divided into 3 groups, Control group, LPS+saxagliptin group (LPS+SAX group) and LPS group. RT-PCR was used to measure the mRNA expression of MCP-1. The protein expression of MCP-1 and the phosphorylation level of NF-κB p65 were analyzed by western blot. ResultsAfter 12 hours LPS stimulation, the mRNA and protein expression of MCP-1 were remarkably up-regulated, and the ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65 were sharply raised. Then, LPS-induced the up-regulation of MCP-1 and the raised ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65 were all noticeably inhibited by saxagliptin in HK-2 cells. ConclusionSaxagliptin down-regulates LPS-induced MCP-1 expression possibly via inhibition of NF-κB in human proximal tubular epithelial cells (HK-2 cells).

基金项目：四川省教育厅科研课题(11ZB172)。

通讯作者：李清福，E-mail:liqingfucdjq2010@163.com

收稿日期：( 2014-10-10； 编辑： 陈舟贵)

Saxagliptin down-regulates LPS-induced MCP-1 expression via inactivation of NF-κB in human proximal tubular epithelial cellsHE Rong1, LI Qingfu1, XIA Ying2,etal

(1.DepartmentofEndocrinology,TheAffiliatedHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu610000,China;

2.DepartmentofTheSecondOutpatient,TheAffiliatedHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu610500,China;

3.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610000,China;

4.WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Key words】Saxagliptin; HK-2 cells; Monocyte chemotactic protein-1; NF-κB

胰高糖素样肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1)属于肠肽类激素(incretin)，主要由肠道内L细胞合成和分泌，具有包括调节胰岛素分泌、糖代谢和脂代谢等多种生理效应[1～4]。进一步的研究发现GLP-1还具有调节能量代谢以外的包括抑制炎症反应、抑制氧化应激、抗器官纤维化以及调节细胞凋亡等多种生物学效应[2～9]。同时发现二肽基肽酶4 (dipeptidyl peptidase, DPP-4)是GLP-1代谢最主要的关键酶，抑制DPP-4可以有效的减少和延迟GLP-1的分解和代谢[2～9]。DPP-4竞争性抑制剂和GLP-1拟似物已广泛应用于Ⅱ型糖尿病的临床治疗[10]。本研究主要观察DPP-4竞争性抑制剂沙格列汀(saxagliptin)对脂多糖(LPS)诱导损伤状态下的人肾小管上皮HK-2细胞的保护作用及相关的分子机制。

1材料和方法

1.1主要试剂和材料人肾小管上皮HK-2细胞购买于中国科学院上海细胞库；PCR试剂盒购自TaKaRa公司；沙格列汀购买于上海施贵宝公司；鼠抗人β-actin抗体、鼠抗人MCP-1抗体、鼠抗人NF-κB p65抗体和鼠抗人phospho-NF-κB p65抗体购于美国Santa Cruz公司；DMEM培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，超纯水。其余试剂均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养人肾小管上皮HK-2细胞常规接种在含10%胎牛血清和青霉素、100 g/L 链霉素的DEME培养液中，置于37℃、95%空气、5 % CO2孵箱内培养。每48 h换液、传代2次，取对数生长期细胞用于实验。HK-2细胞分为对照组(Control组)、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX组)和LPS组。其中对照组细胞加入PBS；LPS组和LPS+沙格列汀组加入LPS (1 μg/ml)；LPS+沙格列汀加入终浓度为0.5 μM的沙格列汀溶液进行干预。

1.2.2细胞MCP-1 mRNA表达检测干预12h后，按照RT-PCR试剂盒说明书提取细胞总RNA。引物：MCP-1正义5′-GCTCGCTCAGCCAGATGCAA T-3′，反义5′-TGGGTTGTGGAGTGAGTGTTC-3′和β-actin正义：5′-CGAGCGGGCTACAGCTTC-3′，反义：5′-GTCACGCACGATTCCCTCT-3′。按照试剂盒说明书介绍进行反转录和扩增实验。应用凝胶成像系统(Bio-rad)摄影，Quantity One软件对目的条带进行扫描分析。用与β-actin PCR产物条带灰度比值作为MCP-1 mRNA的相对表达量。

1.2.3Western blot法检测细胞中MCP-1蛋白表达和NF-κB p65活化水平干预12h后，按操作要求，首先提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1 h，分别加入鼠抗人单克隆抗体MCP-1 (1∶800)、phospho-NF-κB p65 (1∶1000)、 NF-κB p65 (1∶1000)和β-actin (1∶2000)，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

1.3统计学分析采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，计量资料以均数±标准差表示。两样本均数多重比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MCP-1 mRNA和蛋白的表达在干预12h后，对人肾小管上皮HK-2细胞MCP-1 mRNA和蛋白的表达水平使用RT-PCR法和western blot法进行分析。发现与Control组相比较，HK-2细胞在LPS干预后MCP-1 mRNA和蛋白的表达水平显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。同时发现LPS组细胞MCP-1 mRNA和蛋白表达水平较LPS+SAX组细胞增加更加显著，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1和表1。

图1HK-2细胞MCP-1表达的RT-PCR和western blot结果

Figure 1The RT-PCR and Western blot results of MCP-1 in HK-2 cells

Table 1The mRNA and protein expression of MCP-1, and the activation of NF-κB p65 in HK-2 cells(±s)

组别MCP-1mRNAMCP-1蛋白phospho-NF-κBp65/totalNF-κBp65Control组0.17±0.30.15±0.040.19±0.05LPS+SAX组0.63±0.15①②0.54±0.09①②0.58±0.13①②LPS组0.92±0.04①0.96±0.08①0.95±0.12①

注：与Control组相比较①P<0.05；与LPS组相比较②P<0.05。

2.2NF-κB p65活化水平在干预12h后，对人肾小管上皮HK-2细胞NF-κB p65活化水平即NF-κB p65磷酸化水平(phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)使用western blot进行分析。发现与Control组比较，HK-2细胞在LPS干预后NF-κB p65磷酸化水平显著上调，差异均有统计学意义(P均<0.05)。同时发现LPS组细胞NF-κB p65磷酸化水平较LPS+SAX组细胞上调更加显著，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2和表1。

图2HK-2细胞NF-κB p65活化的western blot结果

Figure 2The Western blot results of the activation of NF-κB p65 in HK-2

3讨论

研究发现肾小管上皮细胞损伤及损伤后相关的肾间质纤维化在急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)及多种原发性肾小球肾炎中扮演着重要的角色，保护和减轻肾小管上皮细胞损伤是治疗急性肾损伤和糖尿病肾病等肾脏疾病的关键和重点[11～16]。

胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)属于肠肽类激素(incretin)，主要由广泛分布于小肠和大肠的L细胞合成和分泌[1～9]。研究发现GLP-1的分泌主要呈血糖浓度依赖性控制，即当血糖水平上升时GLP-1释放增多，血糖水平下降时释放减少。二肽基肽酶4 (dipeptidyl peptidase, DPP-4)是GLP-1代谢的关键酶，抑制DPP-4可以有效的减少和延迟GLP-1的分解和代谢[1～9]。沙格列汀(saxagliptin)作为DPP-4抑制剂已广泛应用于Ⅱ型糖尿病的临床治疗[10]。GLP-1主要通过与GLP-1受体(GLP-1R)结合产生相应的生物学效应，实验发现胰腺β细胞表面存在大量GLP-1R，当GLP-1与GLP-1R结合后可通过PKA等信号通路诱导胰岛素的合成和分泌增加，维持体内血糖水平的相对恒定[1～9]。同时近期的研究发现，GLP-1R还广泛表达于胰腺组织以外的多种组织细胞[17～19]。Fujita H等使用基因敲除小鼠证实小鼠肾小球血管内皮细胞表面存在GLP-1R的表达[17]。Thomson SC等人的研究发现大鼠近曲小管细胞存在GLP-1R的表达[18]。Romaní-Pérez M等证实肺组织中II肺泡上皮细胞和气道上皮细胞表明存在GLP-1R的表达[19]。进一步的研究发现GLP-1还具有独立于降糖等调节能量代谢以外的包括抑制炎症反应、抑制氧化应激、抗器官纤维化、调节细胞凋亡和诱导肿瘤细胞自噬等多种药理和生物学效应[9, 20]。Viby NE等的研究发现GLP-1可以有效抑制COPD小鼠的肺部炎症水平并改善其肺功能和死亡率。Gou S等人的研究发现GLP-1可以有效的抑制博莱霉素诱导的小鼠肺间质纤维化[9]。Yi B等的实验发现GLP-1R激动剂exendin-4可以通过抑制晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, RAGE)的表达减轻高脂血症有诱导的心肌细胞凋亡[21]。单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)属于CC类趋化因子家族成员，多种细胞如巨噬细胞、肺上皮细胞、血管内皮细胞和肾小管上皮细胞可在炎症、氧化应激和损伤状态下大量表达[22, 23]。MCP-1可以通过与对应的趋化因子受体，包括CCR2、CCR4和CCR10结合，进一步诱导单核细胞和T淋巴细胞的激活和聚集，同时进一步刺激相应细胞合成和释放炎症介质和粘附分子，对炎症反应产生放大作用[22, 23]。同时研究发现MCP-1的表达水平与糖尿病肾病和急性肾损伤等状态下肾组织炎症程度密切相关[22, 23]。目前部分研究认为血和/或尿液中MCP-1水平可用于DN和AKI严重程度的判定以及治疗效果的检测[22, 23]。同时张继强等人的研究证实下调MCP-1的表达可以有效抑制和延缓DN大鼠肾脏的炎症反应和病理改变[22]。Hu F等人的研究认为在DN和AKI的炎症状态下MCP-1是导致肾小管间质纤维的重要因素，下调MCP-1的表达可以有效抑制LPS诱导的肾小管上皮细胞损伤和小管间质纤维化的发生[23]。本实验中我们使用LPS诱导人肾小管上皮HK-2细胞的炎症反应和损伤。并发现在给予LPS干预12小时后HK-2细胞MCP-1 mRNA和蛋白表达水平明显增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)。同时发现给予沙格列汀干预的HK-2细胞较未干预细胞MCP-1 mRNA和蛋白的表达水平更低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。该结果表明沙格列汀可以有效抑制LPS诱导的人肾小管上皮HK-2细胞MCP-1的合成和表达。

近期研究表明GLP-1对炎症的调控作用与调节NF-κB的活化密切相关[9]。Gou S等人的研究发现GLP-1可以通过抑制NF-κB p65的磷酸化抑制博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化[9]。同时大量研究证实NF-κB信号通路对于MCP-1的表达具有关键调控作用[24]。本实验中我们使用western blot法对NF-κB p65的磷酸化进行分析后发现在给予LPS干预12小时后HK-2细胞NF-κB p65活化水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。且LPS组细胞NF-κB p65磷酸化水平较LPS+SAX组细胞上调更加显著，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果表明在人肾小管上皮HK-2细胞中沙格列汀对LPS诱导的NF-κB p65磷酸化有显著的抑制作用。

4结论

本实验结果表明，DPP-4抑制剂沙格列汀可通过抑制NF-κB磷酸化抑制LPS诱导的人肾小管上皮HK-2细胞MCP-1合成和释放并对其产生保护作用。

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(本刊编辑部)