崔廷婷 ，钟建三 ，张 瑜 ，杨昌松 ，白 莉

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；2.湖南红星盛业食品股份有限公司，湖南 长沙 410004）

红霉素属于大环内酯类抗生素，曾广泛用于畜禽、水产养殖中[1]。但由于该药物可能通过食物链进入人体，产生毒副作用[2]，因此，世界各国对红霉素在食品中的残留限量都进行了规定。我国农业部235号公告[3]和欧盟EC1181/2002[4]规定红霉素在动物组织中的最大残留限量为200μg/kg。目前，医药领域主要通过分析血液、尿液来测定人体内红霉素的残留量[5-6]，食品安全领域主要采用仪器法来分析动物源性食品中红霉素的残留量，如薄层色谱法[7]、液相色谱法[8]、液相色谱-质谱联用法[9-12]等。本试验就使用酶联免疫检测试剂盒测定了动物源性食品中红霉素的残留量，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 红霉素、硫氰酸红霉素、琥乙红霉素、泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素、北里卡星标准品，购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈、正己烷、氢氧化钠、乙酸乙酯、氯化钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠均为分析纯，购自北京化学试剂公司；红霉素残留酶联免疫检测试剂盒，由北京勤邦生物技术有限公司研制；实验所用的猪肉、虾肉、鱼肉等样品均购自北京当地超市。

1.2 仪器与设备 匀浆机：上海斯伯明仪器设备有限公司生产；电子天平：美国Setra公司生产；振荡器：上海跃进医疗器械厂生产；漩涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；低速离心机：上海安亭科学仪器有限公司生产；氮吹仪：北京金科精华苑科技有限公司生产；微量移液器：美国Thermo公司生产；生化培养箱：天津市中环实验电炉有限公司生产；酶标仪：美国Thermo公司生产。

1.3 样品前处理

1.3.1 猪肉、猪肝、鱼肉、虾肉样品。称取1.0g±0.05g均质后的样品至50mL聚苯乙烯离心管中，加入4mL 0.05mol/L氢氧化钠溶液，用振荡器剧烈振荡10min；3000g，室温（20～25℃）下离心 5min；取 200μL上清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入750μL复溶工作液，再加入50 μL 0.1 mol/L盐酸溶液，混匀；从中取50μL用于分析。稀释25倍。

1.3.2 牛肉样品。称取2.0 g±0.05 g均质后的牛肉样品至50 mL聚苯乙烯离心管中；加入10 mL乙腈-0.1 mol/L氢氧化钠溶液，用振荡器剧烈振荡10min；3000g，室温（20～25℃）下离心 5min；取 1mL上层液至10mL洁净干燥玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1mL正已烷，用漩涡混合器涡动30 s；再加入1 mL复溶工作液，涡动30 s；3000g以上，室温（20～25℃）下离心 5 min；除去上层有机相，取下层50μL用于分析。稀释5倍。

1.3.3 蜂蜜样品。称取1.0g±0.05g蜂蜜样品至50mL聚苯乙烯离心管中；加入2 mL甲醇-2%氯化钠（2∶1混合），用漩涡混合器涡动2min至蜂蜜全部溶解；3000g，室温（20～25℃）下离心 5min；移取 100μL清亮样品液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入900μL复溶工作液，混匀；从中取50μL用于分析。稀释20倍。

1.3.4 牛奶样品。取100 μL鲜牛奶样品至2 mL聚苯乙烯离心管中；加入900μL复溶工作液，混匀；取50μL用于分析。稀释10倍。

1.4 检测步骤 向酶标板的微孔中加入标准品或待测样品溶液 50 μL，再加入酶标二抗（50 μL/孔），最后加入抗体工作液（50 μL/孔），混匀，37℃避光反应40 min；洗涤微孔；加入底物液A液和B液各50μL/孔，混匀，37℃避光反应15min，加入终止液50μL/孔，混匀，设定酶标仪于450 nm处测定每孔的吸光度值（OD值）。

式中，A为标准品或样品溶液的吸光度值；A0为0标准品的吸光度值。

以横坐标为红霉素标准品浓度（μg/L）的对数值，纵坐标为标准品百分吸光度值绘制标准曲线图。将样品的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，再乘以其对应的稀释倍数即为样品中红霉素的实际浓度。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线与线性范围 按照1.4的步骤操作，分别测定 0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2μg/L 红霉素标准品的吸光度值，每个浓度取两孔吸光度值的平均值，绘制标准曲线，见图1。其线性方程y=-0.3551x+0.4703，相关系数R2=0.9925，IC50为0.825μg/L。从图1可知，在0.2～16.2μg/L浓度范围内，红霉素浓度与OD450之间线性关系较好，可以确定试剂盒的工作浓度范围为0.2～16.2μg/L。

2.2 检测限 测定20份空白样品中红霉素的含量，检测限等于空白样品测定均值加上3倍标准差，计算结果见表1。猪肉、猪肝、牛肉、鱼肉、虾肉、蜂蜜和牛奶中红霉素的检测限分别为4.13、8.23、0.78、3.75、7.94、3.09μg/kg和 1.87μg/L。

图1 红霉素的标准曲线图

表1 检测限测定结果（n＝20） μg/kg

2.3 准确度和精密度测定 以回收率和批内、批间变异系数（CV）分别表示准确度和精密度。在空白猪肉、鱼肉样品中添加终浓度为10、20 μg/kg的红霉素，在空白猪肝、虾肉样品中添加终浓度为20、40μg/kg的红霉素，在空白牛肉样品中添加2、4 μg/kg的红霉素，在空白蜂蜜样品中添加8、16μg/kg的红霉素，在空白牛奶样品中添加4、8μg/L的红霉素，分别制备以上各浓度的样品10份，用3批不同的试剂盒在不同的时间内进行实验检测，测定回收率和变异系数。

结果表明，用不同浓度的红霉素在空白猪肉等样品中添加，其回收率在69.0%～107.5%范围内，说明试剂盒准确度较好；批内变异系数为5.7%～11.4%，批间变异系数为8.7%～14.0%，均小于15%，说明试剂盒精密度（即重复性）较好。

2.4 交叉反应 选择红霉素、红霉素结构类似物和其他药物，分别配成 0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2μg/L 浓度，测定各药物的IC50。

各药物的交叉反应率用以下公式计算：各药物的交叉反应率（%）＝红霉素IC50/其他药物IC50×100%

从表2可知，试剂盒与硫氰酸红霉素、琥乙红霉素的交叉反应率较高，这与硫氰酸红霉素是合成红霉素的初始原料、琥乙红霉素是红霉素的乙酰琥珀酸酯有关；试剂盒与红霉素的交叉反应率为100%，与其他药物均没有交叉反应，表明试剂盒特异性良好。

3 结论

本研究采用酶联免疫法对动物源性食品中的红霉素残留进行了检测，其在猪肉、猪肝、牛肉、鱼肉、虾肉、蜂蜜和牛奶中的红霉素检测限分别为4.13、8.23、0.78、3.75、7.94、3.09 μg/kg 和 1.87 μg/L；样品添加回收率范围为69.0%～107.5%，变异系数小于15%，检测时间短（55min）；样本前处理简单，检测成本低，适合于大量样本中红霉素残留量的快速检测、筛选，能够更好地满足畜禽生产加工企业、政府监管部门的工作需要。目前，酶联免疫法属于初筛方法，对于阳性样品仍需使用仪器法确证。

表2 交叉反应率计算结果

[1]李洪和.红霉素与洁霉素类药物在养殖中的应用[J].养殖技术顾问，2014（3）:229.

[2]何方洋，郗日沫，万宇平，等.红霉素药物残留检测技术的研究进展[J].四川畜牧兽医，2013，40（3）:31-33.

[3]中华人民共和国农业部.农业部公告第235号动物性食品中兽药最高残留限量[S].2002.

[4]Official Journal of the European Communities Commission Regulation[S].No.1181/2002.

[5]Taninaka C， Ohtani H， Hanada E， et al.Determination of erythromycin， clarithromycin，roxithromycin，and azithromycin in plasmabyhigh-performance liquid chromatography with amperometric detection[J].JournalofChromatography B:BiomedicalSciences and Applications，2000，738（2）:405-411.

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