司云飞，吴德全，胡彦华，裘铠杰，李大川

哈尔滨医科大学附属第二医院普通外科，黑龙江 哈尔滨150086

肝癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一［1］。目前 虽然在肝癌检查和临床治疗上已经有了很大的进步，但是肝癌5 年存活率仍然很低［2］。DAPT 是一种人工合成γ-分泌酶抑制剂，可特异性地抑制γ-分泌酶而抑制Notch 信号的激活，从而影响细胞一系列的生命活动的表达。研究［3］发现Notch 信号抑制剂DAPT 可以在体外抑制人肝癌细胞的增殖、侵袭与转移。但DAPT 对人肝癌细胞MHCC97H 裸鼠皮下移植瘤生长的影响，目前未见报道。本实验通过人肝癌细胞MHCC97H 裸鼠皮下移植瘤模型，观察DAPT 对肿瘤生长影响情况，为DAPT 的抗肝癌体内研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株:人肝癌细胞系MHCC97H，上海复旦大学肝癌研究所惠赠。

1.1.2 实验动物:裸鼠BALB/C-nu，3 ～4 周龄，雄性，体质量11 ～13 g，24 只。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证号(SCXK 京2012-0001)。饲养于哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验室，独立通风屏障系统，SPF 级。

1.1.3 实验试剂:进口优质胎牛血清，购自上海博升生物科技有限公司。DMEM 高糖培养基，购自HYCLONE 公司。DAPT 购自上海惠城生物科技有限公司

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:MHCC97H 细胞采用DMEM 高糖培养液(含10% 进口优质胎牛血清，青链霉素各100 U/L)培养，置于37 ℃，5% CO2培养箱中。细胞均呈单层贴壁生长，每2 ～3 d 换液1 次(0.25%胰蛋白酶消化)，每4 ～5 d 传代1 次。

1.2.2 皮下瘤模型的建立:取对数生长期MHCC97H细胞(2 ×107/ml，0.2 ml 无血清DMEM 制悬)接种于裸鼠背部。

1.2.3 实验分组和给药方案:人肝癌细胞株MHCC97H 接种裸鼠背部1 周后，建立皮下瘤模型，24 只成瘤裸鼠随机分为4 组:高剂量DAPT 组(10 mg/kg，0.03 ml/只)、低剂量DAPT 组(5 mg/kg，0.03 ml/只)、DAPT 溶剂二甲基亚砜(DMSO)对照组(0.05%，0.03 ml/只)、空白对照组(生理盐水，0.03 ml/只)，均行腹腔注射给药。间隔2 d 给药1 次，共给药6 次。

1.2.4 实验观察指标:皮下瘤模型建立成功后，记录各组裸鼠体质量，游标卡尺测量皮下瘤的长径a，横径b，计算公式:体积=1/2 (ab2)计算肿瘤体积，比较用药前体质量及移植瘤体积的差异性。在给药过程中观察荷瘤裸鼠肿瘤生长情况及生存状态，主要包括给药后的进食情况，是否发生抽搐、腹泻等。于末次给药48 h 后采用颈椎脱臼法处死全部裸鼠，称量裸鼠体质量;解剖瘤体，游标卡尺测量移植瘤的长径a，横径b，体积=1/2 (ab2)，计算肿瘤体积;计算抑瘤率，肿瘤抑制率(%)=［(DMSO 对照组瘤体体积-DAPT 组瘤体体积)/DMSO 对照组瘤体体积］×100%。通过抑制率评估DAPT 对人肝癌细胞MHCC97H 裸鼠皮下移植瘤生长的影响。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料用±s 表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮下瘤模型的建立和肿瘤生长状况 人肝癌细胞株MHCC97H 接种裸鼠3 d 后，裸鼠皮下形成小皮丘，1 周后形成明显肿瘤，质稍硬，形状类圆形，24 只裸鼠接种人肝癌细胞MHCC97H 后，均皮下成瘤，成瘤率100%。随着移植瘤的增长，裸鼠开始出现不同程度的活动减少、食欲减退、体质量下降等症状。

2.2 各组裸鼠体质量的变化情况 药物干预前，各组裸鼠体质量比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。药物干预后，高剂量DAPT 组裸鼠体质量较其他3 组明显增加，差异有统计学意义(P ＜0.05)。DMSO 对照组与空白对照组裸鼠体质量比较，差异无统计学意义(P ＞0.05，见表1)。

表1 各组裸鼠皮下瘤模型体质量变化情况(±s)Tab 1 Comparison of body weight of subcutaneous xenotransplanted tumor model among four groups (±s)

表1 各组裸鼠皮下瘤模型体质量变化情况(±s)Tab 1 Comparison of body weight of subcutaneous xenotransplanted tumor model among four groups (±s)

注:与高剂量DAPT 组相比，* P ＜0.05。

体质量(g)组别 例数用药前 用药后高剂量DAPT 组6 14.24 ±1.26 24.34 ±2.63低剂量DAPT 组 6 14.36 ±1.32 20.75 ±2.72*DMSO 对照组 6 14.50 ±1.78 18.86 ±2.83*空白对照组 6 14.27 ±1.24 18.46 ±2.62*

2.3 各组裸鼠移植瘤体积变化及对抑瘤率的影响药物干预前，各组间瘤体体积比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。药物干预后，高剂量DAPT 组和低剂量DAPT 组瘤体体积分别为(1 105 ±277)mm3、(1 360 ±402)mm3，抑瘤率分别为29%、13%，两组比较差异有统计学意义(P ＜0.05);高剂量DAPT 组和低剂量DAPT 组分别DMSO 对照组和空白对照组比较，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。DAPT 对人肝癌MHCC97H 细胞裸鼠皮下瘤的生长有一定的抑制作用，且高剂量的DAPT 对肿瘤的生长抑制效果更加明显，呈药物浓度依赖性。DMSO 对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05，见表2)。

表2 各组裸鼠皮下瘤体积变化(±s)Tab 2 Comparison of volum of subcutaneous xenotransplanted tumor among four groups (±s)

表2 各组裸鼠皮下瘤体积变化(±s)Tab 2 Comparison of volum of subcutaneous xenotransplanted tumor among four groups (±s)

注:与高剂量DAPT 组相比，* P ＜0.05;与低剂量DAPT 组相比，△P ＜0.05。

组别 例数 瘤体体积(mm3)用药前 用药后抑瘤率(%)6 24.6 ±2.6 1105 ±277 29低剂量DAPT 组 6 26.1 ±5.8 1360 ±402* 13*DMSO 对照组 6 27.2 ±8.2 1575 ±350＊△ —空白对照组 6 25.9 ±5.4 1589 ±210＊△高剂量DAPT 组—

3 讨论

癌症患者死亡过程主要是肿瘤细胞的不断增殖，最终使机体耗竭直至出现恶病质状态。寻找能延缓和抑制其生长的药物成为当下癌症治疗的研究热点。研究表明DATP 能有效地下调Notch 信号的表达并且抑制肝癌细胞的侵袭［5］。但关于DAPT 对人肝癌细胞MHCC97H 裸鼠皮下移植瘤生长影响未见报道。

DAPT 是一种人工合成的γ-分泌酶抑制剂，其特异性强，在有效范围内不引起毒副作用。近些年，DAPT 主要应用于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)及对神经干细胞生长影响的研究，并且也已应用于其他的肿瘤临床研究中，如T 淋巴细胞白血病［5］、乳腺癌［6］，发现DAPT 能延缓肿瘤细胞的生长。Notch信号通路在物种的保守进化中起到了关键性的作用，尤其是在其细胞的分化、增殖与凋亡过程中，从而影响正常组织和细胞生长、发育和疾病发生等很多关键环节［4］。有实验［7-9］显示许多肿瘤的发生、发展和转移均与Notch 信号通路的表达异常有关，提示Notch 信号阻断剂DPAT 可能会对肝癌的靶向治疗产生一定的影响。

本实验所用MHCC97H 细胞属于人高侵袭转移肝癌细胞系，由上海复旦肝癌研究所用人肝癌组织经多次分化提纯所得。人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型可模拟人肝癌患者体内生长状况，可作为筛选抗癌药物的相近模型。24 只BALB/C-nu 裸鼠用MHCC97H 细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型均成功，成瘤率100%。本研究说明DAPT 对肿瘤的生长有一定的抑制作用，并且随着药物浓度的增加，抑制效果更明显，具有药物浓度依赖性。高剂量DAPT 组裸鼠体质量与其他3 组比较均明显增加。可能是因裸鼠皮下移植瘤在生长过程中会对自身机体产生消耗，DAPT 对肿瘤产生某些影响即抵制或延缓了这种过程，使裸鼠体质量产生变化。而其分子机制或基因机制仍需进行相关实验进一步探究。本实验结果显示高剂量DAPT 能更好地抑制肿瘤的生长，使裸鼠体质量增加，且提高裸鼠生存状态。预计若裸鼠继续存活，生存率及抗感染率也会有显著提升。

通过本实验观察到，Notch 信号阻断剂DAPT 对人肝癌细胞MHCC97H 裸鼠皮下移植瘤体积生长的抑制和裸鼠体质量变化均有一定的影响，且高剂量的药物浓度作用效果更明显，呈药物浓度依赖性。在给药期间裸鼠的活动正常，未见明显不适反应或死亡现象，提示DAPT 对裸鼠无明显的毒副作用。说明DAPT 抑制MHCC97H 细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。

总之，本实验证实了DAPT 抑制人肝癌细胞MHCC97H 裸鼠皮下移植瘤生长，改善人肝癌细胞MHCC97H 荷瘤裸鼠的生存状态。这为DAPT 治疗肝癌提供了坚实的实验基础。

［1］ Yang JD，Nakamura I，Roberts LR. The tumor microenvironment in hepatocelluar carcinoma:current status and the therapeutic targets［J］. Semin Cancer Biol，2011，21(1):35-43.

［2］ Thomas MB，Zhu AX. Hepatocellular carcinoma:the need for progress［J］. J Clin Oncol，2005，23(13):2892-2899.

［3］ Zhou L，Wang DS，Li QJ，et al. Downregulation of the Notch signaling pathway inhibits hepatocellular carcinoma cell invasion by inactivation ofmatrix metalloproteinase-2 and -9 and vascular endothelial growth factor［J］. Oncol Rep，2012，28(3):874-882.

［4］ Kushwah R，Guezguez B，Lee JB，et al. Pleiotropic roles of Notch signaling in normal，malignant，and developmental hematopoiesis in the human［J］. EMBO Rep，2014，15(11):1128-1138.

［5］ De Keersmaecker K，Lahortiga I，Mentens N，et al. In vitro validation of gamaa-secretase inhibitors alone or in combination with other anti-caner drugs for the treatment of T-cell acute lymphoblastic lecukemia［J］.Haematologica，2008，93(4):533-542

［6］ Osipo C，Patel P，Rizzo P，et al. ERB-2 inhibition activates Notch-1 and sensitizes breast cancer cells to gamma-secretase inhibitor ［J］.Oncongene，2008，27(37):5019-5032.

［7］ Konishi J，Kawaguchi KS，Vo H，et al. Gamma-secretase inhibitor prevents Notch3 activation and reduces proliferation in human lung cancers［J］. Cancer Res，2007，67(17):8051-8057.

［8］ Yeasmin S，Nakayama K，Rahman MT，et al. Expression of nuclear Notch3 in cervical squamous cell carcinomas and its association with adverse clinical outcomes ［J］. Gynecol Oncol，2010，117 (3):409-416.

［9］ Stockhausen MT，Sjlund J，Manetopoulos C，et al. Effects of the histone deacetylase inhibitor valproic acid on Notch signaling in human neuroblastoma cells［J］. Br J Cancer，2005，92(4):751-759.