张兴会，郭 丹，刘 欣，薛 冰，王家明，豆兴堂（辽宁省畜牧科学研究院，辽阳 111000）

电化学发光法对绒山羊孕酮水平检测效果分析

张兴会，郭 丹，刘 欣，薛 冰，王家明，豆兴堂
（辽宁省畜牧科学研究院，辽阳 111000）

利用电化学发光法跟踪测定了绒山羊母羊血清孕酮（P4）水平。结果表明，在发情期的0～3 d P4值为（0.68±0.18）ng/mL；之后孕酮水平逐渐上升，于10～12 d间达到峰值（15.14±3.21）ng/mL，而后开始下降。母羊配种后若妊娠，在推测下一个发情期间，孕酮水平可达（12.24±3.72）ng/mL以上，妊娠中期也会保持相对较高的水平。说明辽宁绒山羊母羊在繁殖季节体内孕酮值随发情周期呈规律性变化。电化学发光法与微粒子发光法测定孕酮值符合度高。

电化学发光法；绒山羊；孕酮

在妊娠早期，母畜外周血浆中的孕酮含量远远高于发情期，所以可以通过测定血液中的孕酮含量来进行早期妊娠诊断。传统的测定方法主要有放射免疫测定法（RIA)、酶免疫测定法（EIA)和乳胶凝集测定试验（LAIT)，但是这些方法由于操作比较复杂，试剂效果不稳定，所以并未得到广泛应用。本课题组于2003年使用EIA法开展了绒山羊早期妊娠诊断研究，利用酶标仪分三批板（48孔、48孔、96孔)测定母羊血清孕酮水平，共计样本164个，包括重复样18对，检测结果变异幅度较大，无规律可循。经查询，电化学发光免疫测定技术（ECLI）具有敏感度高、线性范围大、测定时间短及试剂稳定性长等优点。因此，本研究采用ECLI法测定辽宁绒山羊血清孕酮，现将试验过程报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验设计

在辽宁绒山羊科技示范场，于2014年春季和秋季利用公羊试情，在一个月内共选取发情母羊13只，筛选要求为健康、无繁殖疾病的经产母羊，其中6只本交配种，并定期跟踪测定13只羊的孕酮（P4）水平。

1.2 仪器与试剂

肝素钠抗凝剂：购自上海阿敏生物技术有限公司；低温离心机：Centrifuge5417R，Eppendor；放射免疫测定仪：国产Gc-1200型；全自动电化学发光免疫分析仪：美国贝克曼库尔特UniCelDxI800；干燥箱：上海大东试验设备有限公司；-20℃冰箱：河南新飞电器有限公司；电子天平：MPZO02，上海横平科学仪器有限公司；可调式微量移液器：Eppendorf公司；压力蒸汽灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗凝管的制备 将2mL的离心管洗净烘干后，经高压灭菌，浸泡于1∶500比例配制好的肝素钠溶液中，10 min后烘干备用。

1.3.2 试验羊的采血及处理 应用一次性注射器从颈静脉采集试验羊的外周血液：固定母羊颈部，在颈中1/3处找到颈静脉沟，左拇指施压，使静脉血回流受阻而膨胀，确定血管隆起最高部位，延颈静脉纵向与颈呈45°角，将针头刺入血管内采血3～4mL。将采到的血液装入抗凝管，并做好记录。将采集的血样以3 000 r/min离心15min后分离血浆，-69℃冻存以备测定激素。

1.3.3 指标测定 用化学发光剂直接标记P4，与待测样本中相应的P4反应，通过磁场把结合状态（沉淀部分)的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量及定性检测。

1.3.3.1 电化学反应过程 在工作电极阳极加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌［Rubpy3］2+释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶钌［Rubpy3］3+，同时，电极表面的TPA也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA+，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA。

1.3.3.2 化学发光过程 具有强氧化性的［Rubpy3］3+和具有强还原性的三丙胺自由基TPA发生氧化还原反应，结果使三价的三氯联吡啶钌［Rubpy3］3+还原成激发态的二价三氯联吡啶钌［Rubpy3］2+，其能量来源于［Rubpy3］3+与三丙胺自由基TPA之间的电势差，激发态［Rubpy3］2+以荧光机制衰变并以释放出一个波长为620 nm光子的方式释放能量，而成为基态的［Rubpy3］2+。

1.3.3.3 循环过程 上述化学发光过程后，反应体系中仍存在二价的三氯联吡啶钌［Rubpy3］2+和三丙胺TPA，使得电极表面的电化学反应和化学发光过程可以继续进行，这样整个反应过程可以循环进行。

1.3.3.4 测定 通过上述的循环过程，测定信号不断放大，分离后，检测体系中剩余二价的三氯联吡啶钌［Rubpy3］2+经上述过程后所发出的光，即可得知P4的浓度。

1.4 数据统计

数据采用SPSS统计软件进行统计分析，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

本试验设计为定期跟测处于发情周期天数相同的母羊，而母羊均为自然发情，发情日期并不在同一天，而采血日期相对固定，因此采样时母羊所处发情或配种后天数是不同的，孕酮值为发情后一定区间范围内的统计值。由表1可看出，母羊8～17 d血清的P4水平极显著高于发情0～3 d水平（P＜0.01），10～12 d达到周期中的峰值，显著高于16～17 d的P4值。抽测配种21 d后的血清孕酮值显示，孕酮水平与发情周期的峰值差异不显著（12.24 ng/mL±3.72 ng/mL VS 15.14 ng/mL±3.12 ng/mL，P＞0.05），且血清孕酮值具有随着母羊妊娠天数增加而升高的趋势。

表1 绒山羊孕酮水平检测结果ng/mL

3 讨论与小结

许欣等［1］对85只配种后21 d左右未出现返情的湖羊采用放射免疫测定法（RIA)测定其外周血中的孕酮水平，结果表明，妊娠羊的孕酮含量为（2.33±0.70）ng/mL，未妊娠羊为（1.24±0.33）ng/mL。李爱华等［2］利用孕酮（P4）试剂盒对宁夏地区的舍饲滩母羊的测定结果显示：孕酮含量从泌乳期、空怀期、发情期、妊娠前期和妊娠后期呈递增的趋势，分别为0.05、0.05、0.14、0.17、0.50 ng/mL。而本研究中妊娠羊孕酮含量最低，为（12.24±3.72）ng/mL，且随着妊娠期的延长有上升之势。赵伟等［3］用微粒子化学发光免疫分析技术测定了波尔山羊孕酮浓度的变化。结果显示：发情开始孕酮浓度（1.5±0.23）ng/mL，第7天开始明显升高，达（3.5±0.23）ng/mL，第11天最高，达（8.3±0.23）ng/mL，以后逐渐下降。在妊娠期的最初15 d，激素的变化与发情周期相类似，但第20天后孕酮明显升高，达（12.7±3.3）ng/mL，以后至分娩前维持在较高水平。这与本试验采用电化学发光法所得检测结果较为相似。

从本测定记录来看，母羊配种后，在推算到下一个发情周期时，妊娠羊孕酮检测值（个体测定数据）最低为8.24 ng/mL，最高为18.34 ng/mL，且妊娠中期也会保持相对恒定的水平。这与羊处于发情前后生殖激素的变化规律相符，即周期性黄体溶解后，血清中孕酮水平降至最低，诱发发情与排卵。

本研究可为绒山羊早期妊娠诊断提供测定依据。配种后是否返情是多年来判断受胎与否的主要方法，因隐性发情羊在试情过程中无法挑出，会有部分羊只漏配。而目前，舍饲羊隐性发情现象有增多趋势，为尽早补配，可在推断配种后的下一个发情期阶段进行孕酮检测，来确定是否妊娠。

［1］ 许欣.湖羊早期妊娠诊断免疫胶体金层析试纸条的初步研制［D］.南京：南京农业大学，2010.

［2］ 李爱华，李耀忠，杨凤宝，等.舍饲滩母羊生殖激素变化规律的初探［J］.畜牧与饲料科学，2009，30（5）：54-55.

［3］ 赵伟，王公金，徐晓波.波尔山羊发情周期和妊娠期外周血浆中孕酮、雌二醇和睾酮的浓度变化［J］.江苏农业科学，2004（3）：60-63.

S827.3

A

2095-3887（2015）04-0027-02

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.008

2015-05-15

辽宁省自然科学基金项目（2013020068）、（201202110）

张兴会（1972-），男，高级畜牧师，硕士，主要从事动物繁殖与胚胎生物工程技术研究。